文蛤4个生长相关基因克

发布时间：2020-07-09 12:48

【摘要】：文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)是我国沿海水产养殖的重要经济贝类,具有较高的营养价值和药用价值,深受沿海地区居民的喜爱。随着文蛤人工育苗技术日益成熟,文蛤养殖业呈快速发展趋势,与此同时产业发展对良种的需求愈加迫切。由于文蛤遗传育种研究工作起步不久,需要加强文蛤分子遗传基础研究加快功能基因开发的进程和分子育种实践。本研究根据文蛤转录组文库的注释信息,检索到了4个与生长相关基因的EST片段,包括GRB2、HDAC1、MSTN和α-淀粉酶基因。利用RACE和qRT-PCR技术对该4个基因进行克隆和表达分析,在GRB2和HDAC1基因的外显子区域筛选与生长相关的SNP位点,并比较分析了α-淀粉酶在四种壳色(暗纹、细纹、白壳和红壳)文蛤中的mRNA表达差异和酶活活力差异,研究它们与生长的密切关系,筛选可作文蛤良种选育的候选基因,为文蛤分子遗传育种研究提供基础资料。主要研究结果如下:1.利用SMART RACE技术扩增得到了文蛤GRB2(Mm-GRB2)基因的cDNA全长序列,对其生物信息学、组织及发育阶段表达特征进行了分析,并利用直接测序方法在外显子中筛选SNP位点。结果显示,Mm-GRB2基因cDNA全长1 791 bp,开放阅读框669 bp,编码223个氨基酸,蛋白由SH-SH2-SH3 3个结构域组成;氨基酸序列比对发现,Mm-GRB2与泥蚶的同源性最高,达到65.6%,与脊椎动物的同源性都在60%以上,说明Mm-GRB2基因在进化过程中比较保守。qRT-PCR结果表明,Mm-GRB2在文蛤6个组织和10个发育时期中均有表达,但不同组织间的表达量并没有显著差异;发育时期中的表达量呈现逐渐升高的趋势,在壳顶幼虫时期达到最高,之后表达量又有所降低。SNP位点的筛选结果表明,在Mm-GRB2基因的外显子区域共发现16个SNP位点。2.获得了文蛤HDAC1(Mm-HDAC1)基因的cDNA全长序列,该序列长3065bp,开放阅读框1599bp,编码532个氨基酸;氨基酸序列比对发现,文蛤与其他物种同源性为74.3%-78.7%。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,MmHDAC1基因在文蛤6个组织中均有表达,其中外套膜中的表达量相对最高,并与其他组织间有极显著差异(p0.01);不同发育时期的表达差异结果表明,MmHDAC1基因在壳顶幼虫期表达量最高,显著高于其他发育时期(P0.05)。SNP位点筛查结果表明,在Mm-HDAC1基因的外显子区域发现了19个SNP位点,其中有3个SNP位点(627AT、924TC和1266TC)与文蛤生长相关。3.获得了文蛤MSTN(Mm-MSTN)基因的cDNA全长序列,序列全长2265bp,开放阅读框1671bp,编码557个氨基酸,具有19个氨基酸组成的信号肽。氨基酸序列比对结果显示,文蛤与栉孔扇贝的同源性最高为72%。qRT-PCR结果表明,MSTN基因在文蛤6个组织中均有表达,其中闭壳肌中表达量最高,并与其他组织之间存在显著差异;不同发育时期结果表明,MSTN在担轮幼虫中表达量最高,并与其他时期之间有显著差异。4.利用SMART RACE技术扩增得到MmAmy的cDNA全长序列,分析了其生物信息学及时空表达特征,并研究了4种壳色花纹(暗纹、细纹、白壳和红壳)文蛤MmAmy基因mRNA表达量和酶活力的差异。结果表明:(1)MmAmy(登陆号KP250879)的cDNA全长1783bp,开放阅读框1566bp,编码522个氨基酸,具有19个氨基酸组成的信号肽。氨基酸序列比对发现,文蛤与太平洋牡蛎的同源性最高为73.6%;(2)MmAmy基因组全长6689bp,包括7个外显子和6个内含子;(3)qRT-PCR结果表明,MmAmy基因仅在内脏团中表达;不同发育时期的表达差异结果表明,MmAmy基因在文蛤发育的未受精卵、受精卵、4细胞胚胎、囊胚、原肠胚、担轮幼虫前6个时期中未检测到表达,从D形幼虫开始检测到表达,在壳顶幼虫时期表达量达到最高,并与其他时期有显著差异(P0.05);(4)4种壳色文蛤内脏团中MmAmy基因mRNA表达量和酶活力分析显示,暗纹文蛤MmAmy基因的表达量和酶活(4.36±0.78)均最高,红壳文蛤的MmAmy基因的表达量和酶活(2.8±0.47)均最低,且二者之间有显著性差异(P0.05),此结果又与4种壳色文蛤的生长对比试验(18月龄)结果(暗纹文蛤㧐细纹文蛤㧐白壳文蛤㧐红壳文蛤)吻合,这表明文蛤α-淀粉酶与其生长、壳色之间存在一定的相关性,可作为分子育种的重要候选基因。
【学位授予单位】：浙江万里学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：

电泳图,产物,电泳图,软件预测

果电泳图（左边为 3’RACE 产物，右边为 5’Rphoresis results (left is 3’RACE product, right is cDNA 全长克隆的 cDNA 全长 1 791 bp，开放阅读框 669 b bp，3’-UTR 为 1 097 bp，包含 1 个终止密 bp 的 polyA 尾（图 2-3）。结构预测ompute 推导出 Mm-GRB2 基因编码蛋白质.34。ExPASy Protscale 软件预测显示，该蛋占比例较高，表现为亲水性；SignalP 软件；TMHMM 软件预测没有跨膜蛋白。对文蛤 GRB2 蛋白进行了功能域预测（图

【相似文献】