不同食性鱼类糖代谢关键酶基因克隆及表达比较研究

发布时间：2020-07-10 03:05

【摘要】：本实验以不同食性海水养殖鱼类——罗非鱼(Oreochromis niloticus)、卵形鲳湽(Trachinotus ovatus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)为研究对象,初始体重分别为(31.5±0.29)g、(85.17±1.89)g和(23.33±0.29)g。以糊精为饲料糖源,共设置6个处理组,分低(LD,20%、13%和12%)、中(MD,30%、26%和24%)、高(HD,40%、39%和36%)不同添加水平,以及持续饥饿(S)、饥饿再投喂(R,饥饿4周+投喂4周,投喂MD组饲料)、持续投喂(C,投喂MD组饲料)不同营养状态组,高低水平依次设置等氮等能(罗非鱼:粗蛋白35%、总能13.8KJ;卵形鲳湽:粗蛋白42%、总能16.0KJ;军曹鱼:粗蛋白45%、总能16.9KJ)。每个处理组设置3个重复,每个重复放养鱼20尾,养殖实验持续8W。采用RACE-PCR技术克隆研究这三种鱼糖代谢关键酶GK、PK和PEPCK在蛋白质结构和进化上的区别;比较分析不同食性海水养殖鱼类在不同饲料糖水平和营养状态下GK、PK和PEPCK基因表达量的变化及其酶活性的变化。研究结果如下:1、三种不同食性鱼类糖代谢关键酶GK、PK和PEPCK的基因克隆和序列分析成功克隆了卵形鲳湽的GK、PK(登录号:KM262819)和PEPCK(KJ438292),以及军曹鱼的GK和PK(KM262818)基因的全长c DNA序列。五条基因的ORF:卵形鲳湽的GK基因ORF为1437 bp;卵形鲳湽PK基因ORF为1593 bp;卵形鲳湽的PEPCK基因ORF为1875 bp;军曹鱼GK基因核心片段1356 bp;军曹鱼的PK基因ORF为1599 bp。结果表明三种不同食性鱼类GK、PK和PEPCK基因同源性和进化关系与食性相关,食性相近的物种相似度更高,进化关系更近。2、饲料糖水平和营养状态对不同食性鱼类肝脏GK基因表达和活性的影响不同饲料糖水平下,三种不同食性鱼类肝脏GK的表达量均随饲料糖水平的上升而显著升高(P0.05),三种鱼GK活性整体呈现差异不显著(P0.05)。同饲料糖水平下,军曹鱼的GK m RNA表达水平显著高于卵形鲳湽和罗非鱼,而在同一水平HD组,GK活性变化表明杂食性罗非鱼高于温和肉食性卵形鲳湽,卵形鲳湽高于凶猛肉食性军曹鱼。不同营养状态下,三种不同食性海水鱼肝脏GK的表达量均为S组与R组显著低于C组(P0.05);在相同营养状态下,杂食性罗非鱼和温和肉食性卵形鲳湽S和R组GK m RNA高于凶猛肉食性军曹鱼;而C组GK表达量军曹鱼的显著高于罗非鱼和卵形鲳湽(P0.05),同时C组军曹鱼GK活性增加,显著高于卵形鲳湽(P0.05),而稍低于罗非鱼,整体趋势同GK基因表达量的变化。3、饲料糖水平和营养状态对不同食性鱼类肝脏PK的基因表达和活性的影响不同饲料糖水平下,三种鱼类肝脏中PK表达量均随饲料糖水平增加而显著上升(P0.05),PK活性升高不显著(P0.05);相同糖水平下,三个处理组罗非鱼PK表达量均显著高于卵形鲳湽和军曹鱼(P0.05),两种肉食性鱼类PK表达量之间无显著差异(P0.05),PK活性在LD组和MD组中,罗非鱼和卵形鲳湽显著高于凶猛肉食性军曹鱼(P0.05)。不同营养状态下,三种鱼类肝脏PK的表达量在R组和C组均显著高于S组(P0.05),而PK活性在S组和R组无显著差异(P0.05),军曹鱼PK活性在C组显著降低(P0.05)。相同营养状态下,凶猛肉食性军曹鱼S和R组PK m RNA水平显著高于温和肉食性卵形鲳湽(P0.05),而与杂食性罗非鱼差异不明显(P0.05),在C组中,卵形鲳湽和军曹鱼PK表达量持平,两者均显著低于罗非鱼(P0.05)。S和R组PK活性均表现为凶猛肉食性军曹鱼显著低于罗非鱼和卵形鲳湽(P0.05),而罗非鱼和卵形鲳湽则无差异(P0.05)。卵形鲳湽C组PK活性显著高于罗非鱼,罗非鱼显著高于军曹鱼(P0.05)。4、饲料糖水平和营养状态对不同食性鱼类肝脏PEPCK的基因表达和活性的影响随着饲料糖含量的升高,三种不同食性鱼类肝脏PEPCK表达量呈显著性降低(P0.05),PEPCK酶活性也表现出降低的趋势。同一饲料糖水平下,军曹鱼PEPCK基因表达量高于卵形鲳湽,卵形鲳湽高于罗非鱼,而PEPCK活性在罗非鱼中显著高于军曹鱼,而与卵形鲳湽无显著差异(P0.05)。不同营养状态下,三种不同食性鱼类S组肝脏PEPCK表达量均显著高于R组,R组显著高于C组(P0.05);PEPCK活性在军曹鱼中无显著差异(P0.05),在卵形鲳湽中仅S组显著高于C组,罗非鱼S组PEPCK活性显著高于R组,R组又显著高于C组(P0.05)。在相同的营养状态下,凶猛肉食性军曹鱼S、R和C组PEPCK表达量显著高于卵形鲳湽和罗非鱼(P0.05);S、R和C组PEPCK活性均表现为杂食性罗非鱼的高于卵形鲳湽,卵形鲳湽显著高于凶猛肉食性军曹鱼(P0.05)。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：

糖酵解及糖异生的基本过程

图 2-1 质粒 pMD19-T Vector 的物理图谱Fig.2-1 Physical map of pMD19-T Vector2.1.3 实验仪器设备(1) 无菌操作台（VD-650）：苏州净化设备有限公司；(2) 台式高速冷冻离心机：Sigma，eppendorf 公司；(3) 凝胶成像仪：美国 Biorad 公司；(4) 梯度 PCR 仪（T100 Thermal Cycler PCR 仪）：美国 Bio-rad 公司；(5) 恒压恒流电泳仪：Bio-Rad 公司；(6) 电子天平（MP4002）：上海恒平科学仪器有限公司；(7) 恒温水浴锅（DK-S24）：上海精密实验设备有限公司；(8) 超纯水制备仪（Milli-Q）：广东丹利科技有限公司；(9) 紫外分光光度计（Pharmacia GENEQUANT II）：德国 Eppdorf 公司；(10) 超低温冰箱（-80℃）：美国 Thermo 公司、冰箱（-20℃/4℃）：Haier 公司(11) 移液枪：德国 Eppendorf 公司；(12) 立式压力蒸汽灭菌锅（LS-B35L-11）：江阴滨江医疗设备有限公司；

不同食性鱼类糖代谢关键酶基因克隆及表达比较研究（9）挑取白色单一菌落置于 LB（Amp+）液体培养基中，37 ℃，200 r/min 培2~3 h。2.2.1.7 阳性菌落 PCR 鉴定与测序（1）将上述转化好的菌液进行 PCR 鉴定，反应体系同 2.2.1.3 和 2.2.1.4。（2）筛选出 PCR 克隆的阳性菌，寄样至广州 Invitrogen 公司测序部测序。（3）将测序结果利用生物信息学软件进行目的基因的生物信息学分析。2.2.6 军曹鱼 GK、PK 基因的 RACE 克隆方法步骤同上述卵形鲳湽 GK、PK 的克隆方法。2.3 结果和分析2.3.1 总 RNA 分离从卵形鲳湽和军曹鱼的肝脏中提取的总 RNA，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测可清晰的 18S 和 28S 2 条带，表明总 RNA 完整性良好，且无基因组 DNA 污染（图 2-经紫外分光光度计测定表明 OD260/OD280处于 1.9 至 2.0 之间，满足克隆基因的要求

【参考文献】

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本文编号：2748370