引起急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌MLST及耐药性研究

发布时间：2020-07-11 13:53

【摘要】：对虾急性肝胰脏坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)2009年首次在中国暴发,之后越南(2010),马来西亚(2011),泰国(2012)和墨西哥(2013)菲律宾(2015)等地接连发生。这是一种细菌性疾病,患病对虾死亡率极高(高达100%)。截止到2013年,AHPND给亚洲的对虾养殖产业造成了前所未有的危害,致使每年经济损失超过10亿美元,并且仍有进一步扩大的趋势。2013年Lightner等研究发现引起AHPND的元凶是一种被噬菌体病毒感染后发生了变异的副溶血性弧菌。2015年台湾的研究小组选择自然缺失与实验删除pirA和pirB毒力基因的突变株进行试验,发现两类突变株致病能力均消除,为此进一步证实PirA和PirB毒素是引起急性肝胰腺坏死病的最终病因。在现有的研究基础上,发展面向凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的高效诊断及防控技术研究,是减少AHPND疫情的风险,使虾农受益的关键。本课题从AHPND的诊断入手,建立荧光原位杂交检测方法,可视化的监测环境及对虾组织中的致病菌,进一步证实本实验室保存的AHPND菌株具有致病性。其次是以该致病株为实验材料,并下载国际上其他地区AHPND致病株的管家基因信息,分析全球范围内AHPND致病菌的流行性和遗传学关系。最后我们从基因型和表型两方面研究AHPND致病菌的耐药性,为促进对虾养殖业的健康可持续发展提供理论依据,这对我国的水产生态安全和经济发展具有重要的现实意义。1.VP_(AHPND)荧光原位杂交检测方法的建立本研究基于pirA基因设计荧光原位杂交探针,检测引起对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌。通过序列比对软件ClustalX发现现有的pirA基因保守无突变,采用Primer Premier 5软件设计探针。探针核酸序列通过NCBI数据库BLAST选项初步检验不匹配他种属非AHPND菌株。为进一步验证其特异性,选取21株非AHPND致病菌和12株AHPND致病菌进行验证,FISH检测可以鉴别出12个AHPND阳性样本,与PCR检测方法结果一致。本研究设计的pirA探针与AHPND致病性的副溶血性弧菌杂交时,荧光信号清晰,菌体形状明显。同时用pirA探针检测患病对虾肝胰腺切片时看到有明显的致病菌存在。FISH可以用来检测环境和虾组织中的AHPND致病性的副溶血性弧菌。本研究将为更好地了解这些环境微生物对水产品的危害提供更多的工具。2.引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌MLST新序列型本研究针对不用地区急性肝胰腺坏死病致病性副溶血弧菌,运用多位点测序技术,分析了致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。同时收集不同地区AHPND致病性副溶血弧菌的MLST数据,采用eBURST V3及MEGA 5.0软件进行遗传进化分析。结果显示中国广东分离的AHPND致病菌属于一个新序列型ST1710(42、134、99、79、141、41、51),仅与库中ST415及ST975同源性较高。目前,急性肝胰腺坏死致病株的9种ST型可归为2个克隆组和5个单体。经系统发育树进一步分析可知新序列型ST1710与单体ST975遗传关系相近。AHPND序列型及其相关非AHPND序列型分离株均来自于环境,并且与养殖虾类密切相关。本研究首次报道中国AHPND分离株的序列型,丰富了PubMLST数据库,并为其遗传进化研究奠定了理论基础。3.中国广东急性肝胰腺坏死病分离株的耐药性研究论文第四章主要从基因型和表型两方面研究AHPND致病菌的耐药性,以期为监测耐药菌的出现提供帮助,这对我国的水产生态安全和经济发展具有重要的现实意义。广东分离到的AHPND致病性副溶血性弧菌对氨苄西林(AMP)耐药。氨基糖苷类(AK、CN、K、S),β-内酰胺类(AMC),头孢类(KZ)均有部分菌株中度敏感。其余则为比较敏感。其含耐药基因种类较少,仅携带氨基糖苷类耐药基因aadA2和磺胺类耐药基因sulⅠ,sulⅡ。因此本实验室分离获得的AHPND致病株耐药程度相对较低,对很多抗菌药物的敏感性高,耐药基因种类较少。这在一定程度上也表明该养殖基地药物使用情况良好,但因药物中度敏感菌株较多,仍需继续关注虾类药物耐受情况。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S945.4
【图文】：

序列,基因扩增,毒力基因

上海海洋大学硕士学位论文研人员上传的 AHPND pirA 毒力基因序列，其具体菌株及基因。所有菌株 pirA 毒力基因序列对比后可知目前所发现的 pirA 毒图 2-2），因此可选择其全长进行探针设计。将 pirA 毒力基因序remier 5 软件设计探针，找出评分最高且无发夹结构及错配的序irA 荧光原位杂交探针，根据表 2-1 中探针引物合成探针序列，于后续的实验。

区域图,探针设计,区域,探针

无突变（图 2-2），因此可选择其全长进行探针设计。将 pirA 毒力基因序列粘贴至Primer Premier 5 软件设计探针，找出评分最高且无发夹结构及错配的序列作为本实验的 pirA 荧光原位杂交探针，根据表 2-1 中探针引物合成探针序列，经地高辛标记后用于后续的实验。图 2-1 pirA 基因扩增结果Fig. 2-1 The PCR products of pirAM: 2000 bp Marker; C: Control; 1: F2; 2: F5; 3: F7;4: F11; 5: F12; 6: F14; 7: F18;8: F19;9: G9;10: G10;11: G11;12:G12.

副溶血性弧菌,肝胰腺,对虾,致病菌

2-3 副溶血性弧菌(a,b)ATCC33847 和 G10(c,d)的 pirA 杂交结io parahaemolyticusATCC33847(a,b) and G10(c,d)hybridized with 图 2-4 对虾肝胰腺中致病菌的检测a：阴性对照；b：感染对虾肝胰腺 Detection of pathogenic bacteria in hepatopancreas of Litopenaeus e control; b: The hepatopancreas from the shrimps challenged with V

【参考文献】