凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病防治中草药的筛选

发布时间：2020-07-12 00:57

【摘要】：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界三大养殖虾类品种之一,近年来养殖速度的过快增长造成一系列疾病的暴发,其中急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreas Necrosis Disease,AHPND)是近年来危害最为严重的对虾疾病,目前还没有行之有效的措施防治AHPND,成为制约养殖业发展的重要因素。本研究针对养殖凡纳滨对虾AHPND主要致病菌进行有效抑菌中草药的筛选,并对筛选出的复方中草药对凡纳滨对虾的安全性,免疫性能等进行研究,以期为研发专用中草药、防控AHPND和实现对虾健康养殖提供理论依据和参考。本研究选用抑菌圈法和改良微量二倍稀释法测定了24种广谱抑菌中草药对凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病六种重要致病菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、Vibrio.sp.Ex-25、麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的体外抑菌效果。结果显示,地榆、诃子、黄连和乌梅四味单方中草药的综合抑菌效果最好,他们的平均抑菌浓度(MIC)分别为6.38 mg/ml、7.29 mg/ml、11.98 mg/ml、7.68 mg/ml,平均杀菌浓度(MBC)分别为25 mg/ml、19.27 mg/ml、25mg/ml、16.15 mg/ml。将这四味单方中草药按照正交实验方案设计组成16种复方,进行抑菌实验,结果表明复方抑菌圈和MIC、MBC值均显著优于单方,平均抑菌圈直径最大达到22.08mm,平均MIC最低达到2.67 mg/ml,平均MBC最低为6.90 mg/ml。通过体外抑菌实验发现HD-4复方中草药组的抑菌效果最显著,最佳质量配比为地榆:诃子:黄连:乌梅=1:4:4:4。将不同剂量复方中草药HD-4与饲料粘合,复方中草药HD-4所占比例从40 000 mg/Kg~639 851 mg/Kg等剂量比设计8种不同剂量的药饵饲料,投喂凡纳滨对虾进行口服安全性实验。结果显示,复方中草药HD-4对凡纳滨对虾120 h的半数致死浓度LD50为(138537.17±4881.93)mg/Kg,根据毒理学评价标准判断为复方中草药HD-4是无毒的。实验前后对各组存活凡纳滨对虾体重进行测量,发现各组增重情况整体呈现先高后低的趋势,前5组增重比较显著,组间差异不显著(P0.05),120 h内增重率在20%~30%之间,与6、7、8组差异显著(P0.05);后3组增重幅度明显减缓,尤其是第8组,120 h的增重率不足5%,体重几乎为增长。将复方中草药HD-4以0.5%、1%、2%的比例添加到对虾饲料中,空白对照组投喂基础饲料,阳性对照组投喂1%的酵母细胞壁多糖,投喂30天测定凡纳滨对虾血清中的酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)以及溶菌酶(Lysozyme,LSZ)的变化,分析30 d的体重变化以及研究中草药对凡纳滨对虾组织结构的影响,最后进行人工感染副溶血弧菌实验,分析免疫保护率。结果发现2%中草药投喂组在实验15天和20天时AKP活性均显著高于空白组(P0.05),1%中草药组在第20天时也显著高于空白组(P0.05);1%中草药组在10天和15天时ACP活性均显著高于空白组(P0.05),2%中草药组在实验到10天时达到峰值,与空白组差异显著(P0.05);三个剂量中草药组对SOD和LSZ酶在实验期间没有产生明显的变化。随着中草药添加量的增加,凡纳滨对虾的相对增重率和特定生长率也伴随着增加,其中生长状况最好的是2%中草药组,增重率达到(69.71±0.09)%,特定生长率达到(13.3±2.1)%。采用二次回归曲线获得中草药添加剂量为2.39%时增重率最高。人工感染副溶血弧菌后测定7 d的存活数量,发现0.5%、1%、2%三个中草药组均呈现一定的免疫保护作用,免疫保护率分别为(23.33±6.67)%、(30.00±10.00)%、(46.67±6.67)%。对投喂中草药的凡纳滨对虾取样进行组织切片观察发现中草药对凡纳滨对虾的肝胰腺和中肠组织并没有产生损害。本研究筛选出对凡纳滨对虾的急性肝胰腺坏死病病原菌有显著抑菌效果的复方中草药HD-4,并从临床安全性,非特异性免疫性能等多方面进行分析研究,初步确定该复方安全无毒,对病原菌抑菌效果良好,对凡纳滨对虾有一定非特异性免疫效果,为研发专用中草药、有效防控AHPND和实现对虾健康养殖提供理论依据和参考。
【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S945.49
【图文】：

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