斑马鱼肠道菌群协同竞争关系对嗜水气单胞菌感染的影响

发布时间：2020-07-13 06:57

【摘要】：动物肠道中存在着大量的微生物,在机体生长发育,营养代谢,免疫疾病等生物过程中扮演着重要的角色。随着高通量测序和数据分析技术的快速发展,肠道微生物的研究进入一个更深入的层次。基因组测序结果表明正常动物肠道携带着大量病原微生物,正常情况下并未表现出致病性,但在肠道菌群紊乱时表现出强烈致病性,表明细菌性疾病的的发生可能依赖于肠道菌群结构组成和菌群之间的相互作用。气单胞菌作为一类常见的淡水鱼类病原菌,是引起细菌性败血病主要病因,每年给水产养殖造成巨大的经济损失。研究表明,气单胞菌致病性受到外部环境的影响,而且气单胞菌引起的败血症存在与其他肠道病原菌混合感染的现象,推测气单胞菌感染依赖与肠道微生物的群落组成以及相互作用。故本研究选用抗菌药干扰肠道菌群并结合高通量测序以及网络分析技术,来研究斑马鱼肠道菌群协同竞争关系对嗜水气单胞菌感染的影响,研究结果如下:1.抗菌药对斑马鱼肠道菌群组成的影响斑马鱼肠道菌群主要由变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)组成。甲硝唑处理(J组)以及联合处理组(L组,甲硝唑、头孢他啶、左氧氟沙星联合处理)后的2、7天都能显著改变肠道菌群组成,主要是提高变形菌门比例和降低厚壁菌门以及梭杆菌门的比例,抗菌药处理后17天,甲硝唑处理以及联合处理对斑马鱼肠道菌群组成以及β-多样性与对照组(Z组)相比无显著差异。2.抗菌药对斑马鱼肠道菌群网络关系的影响抗菌药能够使菌群形成不同的网络关系,对比对照组,甲硝唑处理和联合处理,都增加了网络图的节点数(Z=329,J=361,L=571)以及连接数(Z=1123,J=1475,L=2781),使网络关系变得更复杂。在17天时,甲硝唑处理以及对照组的网络关系中存在更多的竞争关系(负/正连接数比,Z=0.21,J=0.32),而联合处理组网络关系中存在更多协同关系(负/正连接数比,L=0.02)。3.斑马鱼肠道菌群中竞争协同关系对嗜水气单胞菌感染的影响斑马鱼肠道菌群中与气单胞菌存在协同关系有鲸杆菌属(Cetobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)以及气单胞菌属(Aeromonas)等,与气单胞菌存在竞争关系有埃希氏菌属(Escherichia)、动球菌科未分类属(Planococcaceae-unclassified)以及伯克氏菌未分类属(Burkholderiales-unclassified)等。甲硝唑能够增加与气单胞菌潜在竞争种数量(P0.05),而联合处理不仅能够提高与气单胞菌潜在竞争种数量(P0.01),还能降低与气单胞菌潜在协同种的数量(P0.01),在17天,相比甲硝唑处理组以及对照组,联合处理组存在大量与气单胞菌潜在间接竞争种数量(P0.01),这可能是联合处理提高斑马鱼存活率的原因。综上所述,无论单独处理和联合处理在处理初期都能显著改变肠道菌群组成和网络关系,但对肠道网络关系的影响时间更长,联合处理能够显著提高斑马鱼对嗜水气单胞菌抵御力的原因可能是联合处理能够提高与气单胞菌潜在竞争种数量并且降低与气单胞菌潜在协同种数量,同时也表明肠道菌群依赖于整个网络的相互作用来抵御病原菌的入侵,而非单一菌之间的相互作用。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.42
【图文】：

图 2-1 实验设计及采样时间点Fig.2-1 Experimental design and sample time注：J 组代表甲硝唑处理，L 组代表甲硝唑、头孢他啶、左氧氟沙星联合处理，Z 组代表对照组流程图表示 J、L、Z 处理后第 2 天为第一采样点记为 day2,处理后第 7 天恢复为第二采样点记day7,处理后第 17 天为第三采样点记为 day17。Note: J, L, Z represents Metronidazole treatment group, Metronidazole, Ceftazidime and Levofloxaccombined treatment group, untreatment group respectively. day 2, 7, 17 represents different sampling tafter treatmet.2.1.4 采样及 DNA 提取将斑马鱼用 MS-222（间位氨基苯甲酸乙酯）麻醉并处死，使用尖头镊子将其整肠道剥离，置于无水乙醇中，于-80℃冰箱保存，以备 DNA 提取。DNA 提取步骤按OMEGA 提取试剂盒说明书进行提取，具体步骤见附录 A。2.1.5 肠道细菌总量定量用细菌 16S rRNA 保守区域设计引物，引物设计参考 Kasie（2017）为 27F （AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），355R（5'-CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'）

图 2-2 肠道细菌总量定量标准曲线Fig. 2-2 standard curve of gut bacterial load quantitation量测序测序，扩增 16SrRNA 的 V4 区域，测序平台为金唯智 IlluminaMiSeq分析原始数据处理使用 Mothur 软件，计算平台为西北农林科技大学超，首先使用 fastqc 软件查看 reads 各位置的碱基质量值分布、碱基eads 各个位置上碱基分布比例、GC 含量分布、reads 各个位置的 测序接头序列等。接着，使用 Trimmomatic 软件去除测序接头序 Mothur 流程进行双端序列合并、过滤、比对以及聚类分析，详thur.org/wiki/MiSeq_SOP）。α-多样性及 β-多样性数据处理使用 R 语计学分析使用 Graphpad prism 6 软件。分析

第二章 抗菌药对斑马鱼肠道菌群组成的影响比例，在抗菌药处理后的第 7 天，对肠道菌群组成影响最大，其中的原因可能是残留少量的抗菌药对肠道菌群的持续作用（附录 C，在抗菌药处理的第 7 天，检测有抗菌药残留），但处理后第 17 天，无论是联合处理（L）处理还是甲硝唑处理（J），斑马鱼肠道菌群门水平的组成基本恢复到对照水平。

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本文编号：2753132