低氧诱导因子-1（HIF-1）对青海湖裸鲤和鲫鱼碱性环境适应的影响

发布时间：2020-07-17 06:37

【摘要】：青海湖位于青藏高原东北部,是高原最大的内陆咸水湖泊,分布着青海湖特有的青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalski)。青海湖裸鲤生活在高盐(9ppt)、高pH(9.0—9.5)、高海拔(平均3260米)的青海湖。鲫鱼(Carassius auratus)分布十分广泛,全国各地水域都有生产,为我国重要的食用鱼类之一。鲫鱼是低氧耐受能力最强的淡水鱼之一,是唯一能在室内不依赖气泵而长期生存的鱼类。低氧诱导因子-1α亚基(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)通常被认为是许多低氧诱导反应的主要开关,在缺氧环境中HIF-1α稳定且表达升高。青海湖裸鲤HIF-1α的ODDD功能域中的羟化酶识别位点的保守序列为:PEMLAP(550-555),与其它脊椎动物保守序列(LXXLAP,X代表任意氨基酸)不符,其脯氨酸羟化保守序列中的第550位氨基酸由Pro代替了在其它所有脊椎动物中的Leu,可影响青海湖裸鲤HIF-1α的稳定,推测可能参与对盐碱湖环境的适应,使青海湖裸鲤具有与普通鱼类不同的碱性水环境适应机制。为了探究HIF-1对鱼类碱性环境适应的影响,本研究主要运用转录组测序技术、荧光定量PCR、Western Blot和流式细胞分析等实验技术对青海湖裸鲤和鲫鱼展开研究,具体内容如下:1.转录组测序分析将捕获的青海湖裸鲤分别进行相应处理后取肝脏组织,提取总RNA,利用Illumina Hiseq高通量测序技术对采取的组织进行转录组测序,获得序列数据碱基数在3800973300-6587446200 bp之间,将高质量数据通过从头组装生成重叠群和单一序列进行后续分析。通过与NR库的比对分析有33785个序列与鲤鱼序列相近,其余相近序列能在14个物种中找到,而17179个序列是对比不到近源物种,属于未知物种;通过对COG分类统计图分析发现青海湖裸鲤肝脏的许多转录本有信号转导机制、复制、重组和修复、翻译后修饰,蛋白质转化率,分子伴侣、细胞骨架等功能。同时KOG分类统计图中发现也有很多转录本对信号转导机制、次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢、转录等方面发挥功能。转录组测序可以从基因的水平上全面的分析不同组之间的区别,同时为后续青海湖裸鲤的有关研究奠定基础。2.关键基因的差异性表达分析对转录组测序结果进行统计分析,对关键基因进行荧光定量PCR。从金华花鸟市场购买鲫鱼,分为中性生理盐水组(pH 7.4,注射生理盐水)、碱性生理盐水组(pH 9.0-9.5,注射生理盐水)、碱性DMOG组(pH 9.0-9.5,注射DMOG 8mg/kg),处理后取肝脏组织,对关键基因进行荧光定量PCR。首先通过对HIF-1靶基因VEGF在不同组中的相对含量,表明了HIF-1α参与青海裸鲤和鲫鱼对碱性环境的应答。其次,发现青海裸鲤和鲫鱼三羧酸循环和糖酵解途径中的关键基因参与碱性环境的适应,其中TCA循环关键酶PDK1和糖酵解关键酶PFK mRNA表达水平均显著高于中性环境,增强糖酵解途径并抑制三羧酸循环,促进裸鲤和鲫鱼对碱性环境下体内高氨水平的适应。第三,发现碱性环境处理抑制裸鲤与鲫鱼谷胺酰胺途径中的关键基因GS和鲫鱼GDH表达水平,并激活鲫鱼GPT酶活。表明HIF-1通过影响Gln代谢参与调节裸鲤与鲫鱼对碱性环境的应答。最后,不同处理脂肪代谢途径关键基因没有发现显著差异。3.相关生理生化指标的测定和细胞增殖与凋亡分析对青海湖裸鲤和鲫鱼进行血氨含量的测定,发现碱性处理会使得鲫鱼血氨浓度显著上升,而DMOG处理导致鲫鱼血氨浓度在碱性环境下能够显著下降。而相比较裸鲤各组并没有显著差异,表明裸鲤的耐氨能力强于鲫鱼。谷丙转氨酶(GPT)活性和还原性辅酶II(NADPH)合成速率的测定分析发现碱性环境处理会使得鲫鱼肝脏GPT的酶活性明显提高,DMOG处理后会使得鲫鱼GPT酶活性显著升高,说明碱性环境会对氨基酸代谢途径的关键酶GPT的酶活性产生影响。通过比较中性环境组(NN)、碱性环境+生理盐水组(AN)、碱性环境+DMOG组(AD)鲫鱼的还原性辅酶II含量发现,DMOG处理碱性环境诱导的鲫鱼肝脏组织NADPH合成速率的降低,显示在鲫鱼对高氨环境的应答反应中,HIF-1对Gln代谢的影响有所差异,这与基因的差异性表达分析结果一致。对293T细胞和草鱼CIK细胞进行氨处理,检测高氨对细胞增殖和凋亡的影响及HIF-1的作用。CCK-8分析发现随着氨浓度的增加,细胞增殖能力减弱,细胞受到的毒性越大。采用流式细胞仪Annexin V-FITC和PI双染检测细胞凋亡,结果显示氨浓度处理的实验组,细胞凋亡率显著增加,而加了1mM DMOG实验组凋亡率有所下降,可见HIF-1的稳定减轻了高氨对细胞的损伤。
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

HIF的结构

羟基化,氧浓度,鱼类,酰胺

图 1 HIF 的结构Fig.1 Structure of HIF1.2 HIF-1α 表达的调节在常氧的情况下，HIF- α 亚基的半衰期很短，细胞不断合成和降解蛋白质[12氧浓度对α亚基降解的调控是通过ODDD域中两个脯酰胺残基（Pro402和Pro56的羟基化实现的。羟基化反应由脯酰胺羟化酶（prolyl hydroxylase, PHDs）催化，活性取决于氧、2-酮戊二酸和辅因子 Fe2+的水平[13,14]。脯氨酸的羟基化使 HIF-1亚基与肿瘤抑制基因蛋白（von Hippel-Lindau tumor suppressor, pVHL）相互作用并通过泛素蛋白酶体通路被降解[15]。在氧浓度下降时脯氨酰基羟基化受到抑制稳定的 HIF-1α 向细胞核内转移并与 HIF-1β 形成 HIF-1 二聚体，然后与目的基因表达调控区域的低氧应答元件结合，调节靶基因的表达[16,17](图 2)。Pro402 和Pro564 在鱼类 HIF-1α 中保守，推测这种调节机制也同样存在于鱼类中。

鱼类,尿素循环,裸鲤,未来研究

筛选差异表达基因。我们的研究为未来研究裸鲤对环境适应进化史提供了丰富的基因组资源。和低氧对鱼类生理指标的影响的生存介质，水环境质量的良好是保证鱼类健康生长的重要的鱼类生长发育要求的水质必须在物理、化学、生物等方面都适着举足轻重的作用[66]。目前对于酸性环境对鱼的呼吸和代谢环性水环境对鲫鱼的代谢途径以及适应机制的研究还不多[67]。指标，高 pH 环境会严重抑制鱼类含氮废物的排出[68]。鱼类主扩散的方式排出含氮废物，不需要额外消耗能量，排尿素动物通过尿素循环排出含氮废物，因此蛋白质代谢途径在鱼类能量于陆地哺乳动物[69]。

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