番石榴叶水提取物对拟穴青蟹免疫功能的影响及其抗MCRV作用初探
发布时间：2020-07-17 15:10
【摘要】：拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是中国东南沿海地区主要的蟹类养殖品种之一,其养殖总产量随着养殖业的不断发展而逐年增长。但近年来以青蟹呼肠孤病毒(MCRV)和青蟹双顺反子病毒-1(MCDV-1)为主要病原的青蟹病毒病频发,严重威胁青蟹养殖业的持续健康发展。番石榴叶作为中草药的一种,其提取物中具有多种降血糖、抗菌、抗病毒及抗氧化作用的生物活性成份,该研究以不同浓度番石榴叶水提取物(Guava leaf water-extract,GLWE)药浴拟穴青蟹,观察其对青蟹成活率、免疫功能的影响及抗MCRV的作用,并通过转录组学方法探究其对青蟹免疫功能和抗病能力影响的分子生物学机制,为后续开发一种蟹用免疫增强剂做理论准备。首先通过预实验确定了正式实验中青蟹的养殖水体盐度为10、密度为10-15只/m~2,且养殖水体中的非离子氨浓度不应超过0.63mg·L~(-1)。之后采用静水法研究不同浓度番石榴水提取物对拟穴青蟹的成活率及血清中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酚氧化酶(PO)和一氧化氮合成酶(TNOS、iNOS)活力的影响,并初步探究GLWE的适宜用药浓度范围。结果表明,实验15 d,各处理组青蟹的成活率随着GLWE浓度的增高呈先升后降的现象且与C0组差异显著(P0.05),其中C40组的成活率最高(55.56%),C0组的成活率最低(22.22%)。用药12 h,C80组的AKP、CAT、PO、iNOS活力均显著高于C0组(P0.05);用药24 h,C20和C40组的SOD、LZM及C40组的ACP、CAT和PO活力均显著高于C0组(P0.05);用药48 h,C10、C20组的CAT活力及C40、C80的TNOS和iNOS活力均显著高于C0组(P0.05);用药72 h,其他各组的AKP活力均显著高于C0组(P0.05),但C40组、C80组的ACP和CAT活力显著低于C0组(P0.05)。该条件下,10-40 mg·L~(-1)的GLWE可在48 h内显著促进拟穴青蟹血清AKP、ACP、SOD、CAT、PO、NOS、LZM活力的升高,其中以20-40 mg·L~(-1)的GLWE效果最优。然后再选取相同浓度的GLWE对自然和人工感染青蟹呼肠孤病毒(MCRV)的青蟹进行药浴,采集相同时间点的各组青蟹肝胰腺进行病毒的定量验证,结果表明自然感染组的MCRV在12 h大量增殖,其中C0与C10组的病毒拷贝数持续升高,并在24 h达到峰值且拷贝数均超过1×10~7 copies/ng RNA;而C20和C40组的病毒拷贝数则在12 h达到峰值,之后开始急速下降,至48 h,C20和C40组的病毒拷贝数始终低于C0组一个数量级;C80组的病毒拷贝数除在24 h低于C0组外,一直处于C0组水平;至72 h,拷贝数的排序依次为C10C80C0C20C40。人工感染组的MCRV在24 h内的变化趋势相似,均在6 h快速增殖,至12 h达到一个小高峰后转为下降,至24 h又恢复到原来水平;之后,C0组的病毒拷贝数急速升高,并在72 h达到最高值且拷贝数达到1×10~6 copies/ng RNA;C80组的病毒拷贝数在24 h后再次升高,至72 h达到最高水平;C20和C40组的病毒拷贝数变化较平稳;至72 h,病毒拷贝数排序依次为C0C80C20C40。说明GLWE对自然或人工感染下MCRV的增殖都具有一定的抑制作用,且这种抑制作用具有一定的药物浓度差异性,其中以20-40 mg/L~(-1)的GLWE效果最优。最后以40 mg·L~(-1)的GLWE药浴拟穴青蟹24 h,通过高通量测序构建了青蟹肝胰腺cDNA文库并找到一些与青蟹的生长、免疫防御与应答等相关的通路或者差异表达基因,选取CAT、SOD、LZM、P50和FADS6基因进行定量验证,结果显示CAT、SOD、LZM、IκBα和FADS6基因的表达量明显上调,分别是对照组的2.18、3.14、5.13、2.66和2.65倍;P50基因的表达量则相对于对照组下调,同时该文库还得到了大量的SSR序列,可以为微卫星标记研究下的拟穴青蟹种质资源的调查、种群分布等生态学研究提供数据支持。综上,可说明GLWE适合作为青蟹免疫增强剂的主要成分进行更进一步的研究。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：
氨氮浓度/mg·L-1死亡率/% mortality rate24 h 48 h对照组(Control group)<0.02)0 040.00 3.33 23.3360.00 26.67 43.3380.00 33.33 66.67100.00 40.00 83.33120.00 60.00 100.00140.00 76.67 100.00经线性回归方程求得，氨氮对青蟹 24 h、48 h 的 LC50 分别为 104.793、66.124mg·L-1，其 SC 为 7.90 mg·L-1。并由上式 (1)、 (2)计算得非离子氨对青蟹 24 h 的LC50为 8.396mg·L-1，对青蟹 48 h 的 LC50为 5.298 mg·L-1，对应的 SC 为 0.63 mg·L-1（图 1-1）。
18图 2-1 番石榴叶水提取物对拟穴青蟹血清免疫相关酶活力的影响Fig.2-1 Effects of GLWE on related immune enzyme activity in serum of S.paramamosain注：图中大写字母代表同一时间点各组间差异，小写字母代表同组内各时间点差异，其中相同字母间代表差异不显著，不同字母间代表差异显著（P<0.05）； * 代表同一时间点处理组与对照组（C0）差异极显著（P<0.01），下同。Note：Capital letters in the figure represent differences between groups at the same time, the lowercase indicate thedifference of the times in the same group, among which the same letters indicate not significant difference, but thedifferent letters indicate significant (P<0.05)； * indicates very significant difference between the control group(C0)and treatment groups at the same time.
TaqR 0.2ssH2O 3.375cDNA 1Total 10n 探针 PCR 法的反应程序：95 ℃ 10 sec95 ℃ 5 sec60 ℃ 20 sec40 cycle70 ℃ 1 sec析实时荧光定量 PCR 标准曲线的绘制质粒拷贝数的 lg 值为 X 轴，以 Cq 值为 Y 轴，建立标准曲线
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：
氨氮浓度/mg·L-1死亡率/% mortality rate24 h 48 h对照组(Control group)<0.02)0 040.00 3.33 23.3360.00 26.67 43.3380.00 33.33 66.67100.00 40.00 83.33120.00 60.00 100.00140.00 76.67 100.00经线性回归方程求得，氨氮对青蟹 24 h、48 h 的 LC50 分别为 104.793、66.124mg·L-1，其 SC 为 7.90 mg·L-1。并由上式 (1)、 (2)计算得非离子氨对青蟹 24 h 的LC50为 8.396mg·L-1，对青蟹 48 h 的 LC50为 5.298 mg·L-1，对应的 SC 为 0.63 mg·L-1（图 1-1）。
18图 2-1 番石榴叶水提取物对拟穴青蟹血清免疫相关酶活力的影响Fig.2-1 Effects of GLWE on related immune enzyme activity in serum of S.paramamosain注：图中大写字母代表同一时间点各组间差异，小写字母代表同组内各时间点差异，其中相同字母间代表差异不显著，不同字母间代表差异显著（P<0.05）； * 代表同一时间点处理组与对照组（C0）差异极显著（P<0.01），下同。Note：Capital letters in the figure represent differences between groups at the same time, the lowercase indicate thedifference of the times in the same group, among which the same letters indicate not significant difference, but thedifferent letters indicate significant (P<0.05)； * indicates very significant difference between the control group(C0)and treatment groups at the same time.
TaqR 0.2ssH2O 3.375cDNA 1Total 10n 探针 PCR 法的反应程序：95 ℃ 10 sec95 ℃ 5 sec60 ℃ 20 sec40 cycle70 ℃ 1 sec析实时荧光定量 PCR 标准曲线的绘制质粒拷贝数的 lg 值为 X 轴，以 Cq 值为 Y 轴，建立标准曲线
【参考文献】
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1 郭s
本文编号：2759593
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/2759593.html
