红白锦鲤不同颜色皮肤鳞片的转录组分析

发布时间：2020-07-23 12:00

【摘要】：红白锦鲤(Cyprinus carpio var.Koi)是鲤鱼(Cyprinus carpio)经人工选育出的变种之一,是一种名贵的观赏鱼。其体表黑色素细胞缺失,体色以白色为基础,同时伴有红色的斑块。其体表的皮肤和鳞片中分布的红色素细胞(显红色)和虹彩细胞(显白色)是决定其红白体色的主要因素,因此红白锦鲤是一种用于红白体色研究的理想材料。为了探究锦鲤中红色体色和白色体色的遗传机制,我们选取了红白锦鲤两种颜色的皮肤和鳞片,利用RNA-seq方法对其进行比较转录组学研究。皮肤和鳞片两个组织间的差异基因分析表明皮肤和鳞片中表达的基因数分别为30005,30384;通过表达量值的比较,发现皮肤和鳞片基因的整体表达水平具有显著差异,鳞片中的表达量高于皮肤。皮肤和鳞片中各找到4042,3787个上调基因,通过富集分析发现两个组织中的上调基因富集的GO Term有显著差异,GO富集显示鳞片中上调基因显著的富集到免疫相关的生物学过程和鳞片的发育相关的生物学过程,关于鳞片的免疫功能还是极少有报道。皮肤中上调基因显著的富集到与皮肤及附属物的形态发生,免疫调控相关的生物学过程,这些富集的生物学过程都是与皮肤特定的功能相适应的。比较红鳞和白鳞的差异基因的GO富集分析结果,红鳞中的223个上调基因显著的富集到神经细胞分化,视黄酸代谢,色素细胞调控和性别决定等生物学过程。神经细胞分化,视黄酸代谢和色素细胞的调控,这些结果为色素细胞起源于神经鞘细胞的学说提供了有力的支持。在很多性别二态性的鱼类中,在繁殖季节两种性别的体色有明显的差异,如溠湉、马口、太平洋鲑等;一般雄鱼的体色表现得艳丽,雌鱼的体色则不太显眼。至于这些性别决定基因是如何控制体色的还有待深入的探究。白鳞中195个上调基因显著的富集到生长调控,细胞迁移和肌细胞功能相关的生物学过程,这些结果说明红色素细胞和虹彩细胞可能具有不同迁移能力。结合之前的锦鲤红皮和白皮的差异基因分析结果,通过对红鳞和红皮中一致性的GO Term进行分析,发现相同颜色的两个不同组织中一致的生物学过程是“脂肪储存(lipid storage)”和“脂肪代谢(regulation of lipid catabolic process)”。这可能是因为类胡萝卜素属脂溶性色素,脂肪的储存与代谢有利于类胡萝卜素的吸收与代谢。白皮中的上调基因和白鳞中的上调基因一致性的富集结果中,最显著富集的生物学过程是横纹肌发育,这表明虹彩细胞中载色体晶体可能具有较强的活动能力。比较红皮和白皮,红鳞和白鳞的差异基因,筛选出22个在皮肤和鳞片具有相同表达模式的基因,其中包含视黄酸代谢相关基因(cyp2ae1,box1,opsin5),转运蛋白(slc2a11b,bscl2和tmem130),以及神经细胞特异性表达的基因(syt11b和nell2b)。β胡萝卜素加氧酶(box1)是将β-β胡萝卜素转化成视黄醛分子的关键酶,box1基因在红皮和红鳞中均为特异性表达的基因。opsin5属于视蛋白基因家族,通过与视黄醛集合成视紫红质,不论是在有视觉动物和还是无视觉动物中都是感光分子。同时利用现有的鲤鱼Pacbio全长转录组测序数据,采用ISO-Analysis全长转录组分析软件共获得113418条全长转录本。在筛选出的22个体色相关的候选基因基因中,共检测到10个基因的全长转录本。除此外,还开发了一款Pacbio全长转录组分析软件ISO-Analysis,ISO-Analysis能够利用Pacbio下机数据得到一致性序列,对一致性序列进行分类,还能实现基因注释,基因和转录本水平的定量分析。对比当前广泛使用的全长转录本分析软件SMRT-link,ISO-Analysis具有更高的去接头效果,能够获得更多的全长转录本,有效提升了数据的利用率。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

锦鲤,图片,离心管

白色鳞片(图 2-1 c)以下简称白鳞，红色皮肤(图2-1 d)以下简称红皮和白色皮肤(图 2-1 e)以下简称白皮 4 种组织。取皮肤时用解剖刀剥离粘附在真皮层的肌肉以避免组织的污染，取鳞片时仅取顶部区域的部分。然后将不同样本的相同组织进行混合，混合后的组织用于总 RNA 的提取。2.1.2 总 RNA 提取将上述采集到的 20 条鱼的 4 种组织使用 Trizol Reagent 试剂进行总 RNA 提取。具体操作步骤如下：取 1.5mL 的无 RNA 酶的离心管，加入 1mL Trizol Reagent。取约 0.5g 组织组织放入经过 180℃高温烘烤灭菌的研钵中，加入液氮充分研磨成粉末。取约 50mg 的充分研磨后的组织加入到已经加入 Trizol 的 1.5ml 离心管中，剧烈震荡 15s。多余经研磨后的组织放入离心管中-80℃保存备用。往加入 Trizol 和组织粉末的离心管中加入 200μL 氯仿，震荡混匀 30s，然后室温静置 5min；4℃下以 12000g 离心力离心 15min；小心吸取离心管中的上清液(约500uL)转移至新的离心管中，加入500μ（L-20℃预冷）异丙醇

分析流程,测序

上海海洋大学硕士学位论文测序饱和度评估了确保测序数据量能够准确的评估转录本的表达量，在进行定量分析分析之前，使用 RSeQC 软件[83]采用重新抽样的方法来评估测序饱和度测序数据重新抽样生成 20 个子集，通过 RSeQC 来评估每个子集的中基当基因表达量不随测序数据量增加而增加时，就认为测序深度达到饱效的覆盖大部分基因并准确评估其表达量。

过表达,基因对,皮肤,表达水平

上海海洋大学硕士学位论文两个组织中所有基因整体表达水平接近(图 2-1 a)。但在富集的 GO Term 上有明显的差异，分别对皮肤和鳞片两个组织中激活表达的基因进行 GO 富集分析，第四层 GO Term 的卡方检验的结果显示有 108 个是过表达或低表达的(图 2-3 b, Chisquare test p value < 0.05)，这表明皮肤和鳞片之间的基因表达存在显著差异。

【参考文献】