凡纳滨对虾肾素—血管紧张素系统与盐度应激关系的研究

发布时间：2020-07-24 03:27

【摘要】：凡纳滨对虾(旧称南美白对虾,Litopenaeus vannamei)是一种广盐性的海水养殖品种,生长快、存活率高、抗逆性强,广受水产养殖业的青睐,是全球三大养殖对虾之一。随着其养殖产量的逐年升高,加之不科学的管理方式,海水养殖环境越来越差。因此越来越多的人用淡水养殖凡纳滨对虾,但是低盐度条件下凡纳滨对虾会出现一系列的应激反应,导致对虾免疫力下降,阻碍生长等。为了解决这一难题,研究人员开展了大量有关低盐度胁迫与凡纳滨对虾应激关系的研究,但是对内分泌与盐度应激的研究却很有限。因此本文以凡纳滨对虾为研究对象,从转录组、mRNA和蛋白水平三方面入手来探讨其肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAS)与盐度的应激关系,以期为低盐度胁迫对甲壳类及其他水生动物内分泌影响的研究提供一定的参考。1.长期低盐度胁迫下凡纳滨对虾眼柄的转录组学分析凡纳滨对虾眼柄中的X器官-窦腺复合体为机体内分泌的控制中心,所以本章采用Illumina高通量测序技术,分析了长期低盐度(3psu)胁迫对凡纳滨对虾眼柄内基因表达的影响(25psu为对照组),以探究凡纳滨对虾内分泌与盐度应激的关系。De novo RNA测序共筛选出6.17×10~7 reads,总长度为8.98×10~(10) bp。利用Trinity软件对结果进行拼接、比对后,得到17,222条Unigene,总长度为1.88×10~7 bp。通过功能注释及KEGG富集分析,得到差异表达基因的个数为479(fold change2,P value0.05),其中上调基因150个,下调基因329个。有10个与内分泌调控相关的基因发生了显著的变化,其中肾素-血管紧张素系统的变化最为显著(P=0.016),此系统中的血管紧张素转换酶(ACE)和氨肽酶N(AP-N)均出现显著下调。随后,随机从显著变化的基因中选择20个进行实时荧光定量PCR验证,结果进一步证明了转录组数据的正确性和可靠性(R=0.97)。本研究表明,凡纳滨对虾体内的肾素-血管紧张素系统在适应长期盐度胁迫过程中发挥了重要的作用,是凡纳滨对虾渗透压调节的重要环节。本研究不仅能为探究凡纳滨对虾渗透压调节提供新的思路,也能为甲壳动物内分泌系统的研究提供一定的参考。2.凡纳滨对虾肾素-血管紧张素系统中关键基因的克隆与分析血管紧张素转换酶(ACE)、氨肽酶N(AP-N)、血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT_1R)和肾素受体(RR)在RAS通路中发挥很重要的作用,因此本研究对这四个基因进行了片段克隆及生物信息学分析。最终得到四个基因分别对应2326bp、3100bp、593bp、1116bp核苷酸序列。其中ACE的分子质量为79kDa,等电点为6.0,脂肪族指数为77.65,有信号肽,有48个磷酸化位点,无跨膜结构域,O-糖基化位点为5个,N-糖基化位点为4个。AP-N的分子质量为104kDa,等电点为6.13,脂肪族指数为85.32,有信号肽,有102个磷酸化位点,无跨膜结构域,O-糖基化位点为9个,N-糖基化位点为10个。AT_1R的分子质量为19kDa,等电点为4.73,脂肪族指数为90.29,无信号肽,有19个磷酸化位点,有2个跨膜结构域,O-糖基化位点为1个,N-糖基化位点为2个。RR的分子质量为36kDa,等电点为4.95,脂肪族指数为97.18,有信号肽,有34个磷酸化位点,有1个跨膜结构域,O-糖基化位点为3个,N-糖基化位点为4个。并构建了系统进化树,进行了同源性比对分析。结果发现,与凡纳滨对虾这四个基因同源性较高的物种都是与其分类阶层离得较近的物种。3.盐度应激下凡纳滨对虾肾素-血管紧张素系统中关键基因的mRNA表达得到ACE、AP-N、AT_1R和RR四个基因片段之后,选取眼柄、肝胰腺和肌肉组织,进一步做了实时荧光定量PCR实验,分析其m RNA的表达水平。结果发现四个基因在所测组织中均有表达。在长期低盐度胁迫过程中,凡纳滨对虾眼柄中ACE和AP-N的表达量显著低于正常盐度组,而AT_1R和RR均无显著性差异,与转录组的结果一致。其它差异基因在低盐度胁迫下的表达都呈下降趋势,表明低盐度胁迫下凡纳滨对虾眼柄中的RAS水平受到抑制。在肝胰腺中,低盐度下ACE的表达显著下调。另外,在急性低盐度胁迫过程中,分别检测眼柄、肝胰腺和肌肉中ACE、AP-N、AT_1R和RR在0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h和96h的mRNA表达量。结果发现,眼柄中ACE和AP-N比AT_1R和RR敏感,最先出现表达差异。同时,ACE和AP-N可能处于一个动态的、间断性的调节过程,以不断适应这种低盐度胁迫对机体造成的应激。四个基因在肝胰腺和肌肉中的响应均不如眼柄强烈。其中ACE的表达在96h内均无差异,表明肝胰腺和肌肉中的ACE在适应低盐度胁迫的过程中不发挥作用。总之,在凡纳滨对虾适应低盐度胁迫过程中,ACE、AP-N、AT_1R和RR在不同组织中的表达变化有所差异。4.凡纳滨对虾血管紧张素转换酶抗体的制备及其在盐度应激下的表达研究通过克隆出来的ACE基因片段,对序列进行氨基酸分析、疏水性分析以及抗原性分析,确定最终合成抗体的氨基酸区域为463-643。随后全基因合成目的基因片段,获得PCR产物,并构建到pET28a和pET32a载体中诱导目的蛋白表达,对得到的蛋白进行纯化和定量,进而免疫新西兰白兔,收集血清并进行纯化,用酶联免疫吸附(Elisa)的方法鉴定其特异性和滴度,所得抗体效价达1:80000,特异性强,并利用该抗体通过蛋白质印迹(Western blot)检测ACE在长期低盐胁迫下凡纳滨对虾的眼柄和肝胰腺中的蛋白表达变化情况。结果表明,低盐度胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺中ACE蛋白的表达量著低于正常盐度组。于是推测,低盐度胁迫下眼柄中ACE蛋白的表达量也可能显著低于正常盐度组,具体的相关结果有待进一步研究。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

肾素-血管紧张素系统

华东师范大学硕士学位论文第一章文献综述第一节动物肾素-血管紧张素系统的研究进展一、肾素-血管紧张素系统的介绍肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)（如图 1.1）是动物体内的一个非常复杂的内分泌系统，由一系列多肽和酶组成，包括肾素（Renin）、血管紧张素转换酶（ACE）、血管紧张素原（AGT）、血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及其受体等(冉海红和张然,2011)，具有调节动物体内水盐平衡、渗透压和血压等作用(Ames, 2002)。

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2.1 长期低盐度胁迫下凡纳滨对虾眼柄中表达差异 Unigene 分布的火山图图中横坐标表示长期低盐度胁迫下凡纳滨对虾眼柄中差异基因 Fold Changelog2 的值，纵坐标表示差异基因 P-value 取-log10 的值。图中黑色竖线依次表-2 和 2 倍差异阈值；黑色横线表示 P-value = 0.05 的阈值。

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图 2.2 长期低盐度胁迫下凡纳滨对虾眼柄中表达差异 Unigene 分布的 MA 图图中横坐标表示长期低盐度胁迫下凡纳滨对虾眼柄中差异基因的表达强度；坐标表示 P-value 取-log10 的值。MA 图表示凡纳滨对虾眼柄中差异基因在不盐度下的表达差异趋势不随表达量大小的变化而变化。表达差异 Unigene 的 GO 富集分析对表达差异 Unigene 做了 GO 富集分析，如图 2.3，发现其主要富集ogicalProcess、Cellularcomponent、MolecularFuction 三大类生物过程三大类生物过程中富集显著的 Unigene 主要集中在 proteinmaturatiocellular region 中。

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