斑马鱼卵母细胞的体外成熟及卵母细胞的玻璃化冻存

发布时间：2020-07-25 09:52

【摘要】：本文以斑马鱼为研究对象,通过亮甲酚蓝染色法判断卵母细胞成熟度和采用不同浓度、不同处理时间17α-羟基孕酮处理斑马鱼卵母细胞,对斑马鱼卵母细胞体外促成熟进行研究;通过采用不同配方玻璃化冻存液冻存,并结合冻存后细胞存活率的检测,对斑马鱼卵母细胞玻璃化冻存条件进行筛选;通过检测冻存后细胞中三种线粒体ATP酶(Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Na+K+-ATP酶)的活性和谷胱甘肽含量变化,对玻璃化冷冻保存对斑马鱼卵母细胞的损伤作用等进行研究。主要研究结果如下:(1)比较通过亮甲酚蓝染色法和卵母细胞直径大小、细胞形态判断卵母细胞成熟度的结果,判定亮甲酚蓝染色法用于斑马鱼卵母细胞成熟度的评估可行且更便捷。筛选出亮甲酚蓝染色浓度为20μmol/L、染色时间为150min的染色效果最佳。(2)实验以不添加17α-羟基孕酮的培养液为对照组,以浓度分别为1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L的17 a-羟基孕酮培养液为实验组,对斑马鱼卵母细胞进行体外培养6 h、12 h和24 h,以亮甲酚蓝染色法评价卵母细胞的体外成熟情况。结果表明:1)17α-羟基孕酮对斑马鱼卵母细胞的存活率没有明显影响;2)17α-羟基孕酮浓度为1 nmol/L、10 nmol/L处理6 h,卵母细胞的成熟率分别为50.99%和44.30%,但与对照组比较差异不显著,因此推断低浓度的17α-羟基孕酮(1 nmol/L和10 nmol/L)对斑马鱼卵母细胞的成熟无明显促进作用;17α-羟基孕酮浓度为1000 nmol/L处理6 h,卵母细胞的成熟率分别为33.30%,与对照组相比成熟率下降明显,说明高浓度的17α-羟基孕酮(1000 nmol/L)对卵母细胞的成熟反而不利;17α-羟基孕酮浓度为100 nmol/L、处理12 h后,成熟率为40.72%,显著高于对照组(p0.05),对卵母细胞成熟有明显的促进作用。3)17α-羟基孕酮浓度在1-1000 nmol/L区间处理6小时,斑马鱼卵母细胞半成熟的比率随孕酮处理浓度的增加而增加,都高于对照组,且在100 nmol/L和1000nmol/L剂量组半成熟的卵母细胞比率分别达47.92%和56.48%,与对照组相比差异显著(p0.05),说明17α-羟基孕酮对卵母细胞在成熟的过程中有一定的促进作用,且孕酮浓度越大效果越明显。(3)设置9组(V1~V9)配方不同的玻璃化液对斑马鱼卵母细胞进行玻璃化冻存(-196℃),分别检测冻存1d、2d、4d和8d后卵母细胞的存活率,结果表明:V4组的存活率最高,且显著高于其它组,其卵母细胞存活率在冻存1d、2d、4d和8d后分别为48.89±2.58%、39.35±1.34%、24.18±2.32%和14.56±1.64%,冻存1-2d效果较好,但随着冻存时间的增加,卵母细胞存活率明显下降;该玻璃化液组分是:1.5mol/L甲醇、6.0mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖。(4)对玻璃化冻存后斑马鱼卵母细胞的线粒体ATP酶的活性和谷胱甘肽含量进行了研究。结果表明:1)各实验组Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Na+K+-ATP酶活性在冻存1d、2d、4d和8d后均显著下降,其中V4组的各种酶活性相对较高,经检测其Ca2+-ATP酶活性在冻存1d、2d、4d和8d后分别为:3.823±0.144U/mgprot、3.492±0.084U/mgprot、2.554±0.097U/mgprot和1.930±0.076U/mgprot;Mg2+-ATP酶活性分别为4.503±0.144 U/mgprot、4.134±0.182U/mgprot、2.972±0.096U/mgprot和2.113±0.073 U/mgprot;Na+K+-ATP酶活性分别为7.520±0.198 U/mgprot、5.828±0.184 U/mgprot、3.204±0.197 U/mgprot和2.031±0.176 U/mgprot。2)各实验组的谷胱甘肽含量经检测后发现也是随着冷冻保存天数的增加而显著下降,其中V4组的谷胱甘肽含量显著高于其它组,其含量在冻存1d、2d、4d和8d后分别为13.37±0.59mgGSH/gprot、10.57±0.73 mgGSH/gprot、6.25±0.89 mgGSH/gprot和4.16±0.57 mgGSH/gprot。3)综合分析各项检测数据结果表明,细胞的活性随着冻存天数的增加而逐渐下降,说明玻璃化冻存不能完全避免低温和冷冻保护剂的毒性对卵母细胞造成损伤。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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本文编号：2769667