草鱼呼肠孤病毒三顺反子基因组片段的鉴定及其编码蛋白NS31的功能研究

发布时间：2020-07-26 15:04

【摘要】：水生呼肠孤病毒(Aquareovirus genus,Reoviridae)是危害鱼类健康的重要病原之一,其中草鱼呼肠孤病毒(Aquqreovirus C/Grass carp reovirus,GCRV)是草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病的致病病原,GCRV为非囊膜分节段双链RNA(dsRNA)病毒。近几十年来从草鱼中先后分离鉴定出3种GCRV基因型(代表病毒株:I型,GCRV-873;II型,GCRV-HZ08;III型,GCRV-104)。GCRV I型基因组(GCRV Typle I)是由11条分节段(基因组片段)的dsRNA构成,一直公认其编码12个蛋白;其中Segment7(S7)节段的上游编码一个膜融合蛋白(Membrane fusion protein)NS16,下游编码一个功能未知的蛋白NS31。本研究主要阐述I型GCRV-S7编码特性(三顺反子)及其编码蛋白NS31与宿主细胞热休克效应的相互关系(NS31转录调控HSP70表达)。主要研究内容如下:1.GCRV-S7是病毒的一个三顺反子(Tricistron)病毒核酸序列分析发现在GCRV-JX01-S7中,除了NS16和NS31的编码阅读框(Open reading frame,ORF)之外,还有第三个阅读框的存在(195-518 nt),其编码一个预测大小为11.93 kDa的蛋白(107 aa),暂命名为NS12;通过RT-PCR,免疫印迹,间接免疫荧光以及串联质谱等一系列实验证明NS12并不是一个假性基因(Pseudogene),其在病毒复制过程中有效表达;通过表达动态分析发现NS12在病毒感染中后期表达。蛋白氨基酸序列分析发现NS12与NS16一样,也含有一个保守的跨膜结构域;膜蛋白组份分离实验说明NS12的确是一个膜相关蛋白,但NS12蛋白膜融合诱导实验说明NS12并不能够直接诱导宿主细胞的合胞体形成(膜融合)。同样在其它水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus-A,B,G)的11株病毒中也发现NS12同源蛋白,说明NS12相似蛋白在Aquareovirus属中广泛存在(通过ATG或非ATG起始位点翻译),在病毒感染过程中行使保守功能。以上结果说明GCRV-S7节段编码3个蛋白,是呼肠孤病毒中一个新鉴定的三顺反子,推测S7通过leaky-scanning和ribosome-shunting机制分别翻译下游编码蛋白(NS12和NS31)。2.在酵母中鉴定NS31的转录活性在分析S7节段编码特性基础上,进一步探索其编码蛋白NS31的功能:利用层析方法纯化GCRV-JX01病毒粒子,原核表达纯化NS31蛋白用于制备多克隆抗体,利用免疫印迹实验证实NS31是病毒编码的非结构蛋白,其在病毒感染的中期开始表达,这与外衣壳蛋白VP7和VP5表达基本一致;利用酵母报告系统分析发现NS31是唯一一个GCRV编码具有转录活性的蛋白(Transcription Activator);在酵母中融合蛋白NS31-BD的强转录活性依赖于其全长的完整性,NS31蛋白的N-端和C-端与BD融合具有微弱的转录活性,并且NS31中段(131-214aa)调控(抑制)其自身转录功能,这一过程可能与其亚细胞定位特性有关;并且NS31-BD在酵母中活化报告基因的转录依赖于BD结构域。我们可推测NS31-BD融合蛋白通过BD结构域直接靶向报告基因启动子,从而NS31像Gal4-AD一样在酵母中活化报告基因的转录。由于GCRV是dsRNA病毒,其在细胞质内复制装配,其自身的基因组复制并没有转录的步骤(DNA转录为RNA),故推断NS31可能是参与宿主基因转录的调控因子。3.NS31选择性转录调控宿主细胞热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)表达在酵母中NS31展现出转录调控功能,进一步寻找NS31的可能性转录靶标:通过转录组测序结果分析发现NS31在CIK细胞中过表达能够上调HSP70 mRNA水平,同时病毒感染12h和20h也能上调HSP70 mRNA水平;进一步制备特异性识别草鱼HSP70蛋白多克隆抗体,定量RT-PCR和免疫印迹实验表明:在未感染GCRV鱼类细胞中HSP70表达极低,难以检测到;在NS31过表达或病毒感染的细胞(CIK和GCO)中,HSP70基因上调表达(转录及蛋白水平),并且GCRV感染细胞后检测到HSP70蛋白表达随着NS31表达逐渐升高;进一步对HSPs家族基因(HSP30,HSP90,HSC70和HSF1等)表达分析发现NS31选择性调控HSPs表达(仅有效诱导HSP70表达)。克隆HSP70基因上游启动子区(2000bp左右),应用双荧光素酶报告系统证明NS31特异性调控HSP70启动子表达;对NS31截断体功能分析发现其C-端(1-74 aa)和N-端(214-274 aa)可能是调控HSP70表达的功能区域。依据本部分结果推测GCRV病毒通过NS31转录调控诱导宿主HSP70表达。4.NS31转录调控HSP70机制及其对病毒感染效率的影响本部分首先应用双荧光素酶报告系统鉴定NS31转录活化HSP70基因的核心启动子,发现HSP70翻译起始位点上游-791/-429序列是NS31活化的必需位点;同时利用EMSA实验阐明NS31(杆状病毒表达系统表达NS31蛋白)与HSP70核心启动子并不能够体外直接结合;推测NS31可能通过与HSP70调控蛋白结合行使转录功能。利用pull-down联合质谱鉴定与NS31相互作用的宿主蛋白,其中发现NS31能够与共转录因子p300相互作用;进一步发现利用p300抑制剂或shRNA干扰技术敲降p300能够抑制GCRV感染或NS31表达对HSP70表达的诱导作用,说明NS31调控HSP70转录依赖于p300共转录因子。最后利用HSP70抑制剂或HSP70过表达评估HSP70表达丰度对GCRV感染效率的影响,发现HSP70能够促进GCRV感染,其可能成为抗病毒靶标的潜在因子。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943
【图文】：

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图 1-1 水生呼肠孤病毒粒子内部结构和基因组简图(图片来源[23])Figure 1-1 Schematic of aquareovirus inner viron and genomealfoftheicosahedral capsidisremovedtoshowthestructuresofthegenomicdsRNt layer in orange and second layer in yellow), RdRp VP2 (magenta), and cofacto[23]

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图 1-2 RNA 病毒非经典翻译机制（图片来源[36]）Figure 1-2 Non-canonical translational mechanisms in RNA viruses.Canonical eukaryotic mRNA translation is shown in the top panel. Red arrows indicatinitiation of protein synthesis (at the start of an ORF) or continuation of translation b

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墙峁沟鞍住Ｈ缭?GCRV 中还编码另外 3 个非结构蛋白（图1-3），NS38，NS31（推测）和 NS26;NS38 被 NS80 招募到病毒包涵体中[61]，能够与内衣壳蛋白 VP1-VP4，VP6 和 NS80-RNA 复合物相互作用，也能够与宿主翻译起始因子 3 相互作用（eIF3A），说明 NS38 和哺乳动物呼肠孤病毒 σNS 功能相似，可能参与病毒的包涵体形成，病毒组装和病毒蛋白的翻译等过程[71,72]；NS31 功能未知（仅发现存在于水生呼肠孤病毒属）

【参考文献】