嗜水气单胞菌毒力基因检测及其在锦鲤组织中的分布研究

发布时间：2020-07-26 17:12

【摘要】：嗜水气单胞菌是水产养殖中常见的致病菌,能引起大规模渔业疫情的爆发,给渔业养殖带来巨大经济损失。此外,也有相关报道该菌能够引起鸟类和哺乳类的腹泻和败血症。因此,嗜水气单胞菌的相关研究受到了国内外的广泛重视。本文从实验菌株的毒力基因检测、人工感染试验、细菌鉴定和细菌的组织中分布情况等方面进行初步研究,相关研究结果为有关嗜水气单胞菌的传播途径和致病机理提供理论支持。实验菌株由上海海洋大学杨先乐教授实验室惠赠,菌株经NB液体培养基活化后提取核酸。嗜水气单胞菌的毒力基因检测实验是根据已报道的气溶素(AH-78-2-Aer)基因的保守序列设计特异性引物,利用PCR技术对嗜水气单胞菌气溶素基因进行扩增,获得了气溶素基因的特异片段。测序结果证明扩增片段为气溶素基因,其同源性与已报道的嗜水气单胞菌气溶素基因同源性为99%。基于此,显示实验菌株带有毒力基因,是有致病性的嗜水气单胞菌。以锦鲤为试材,对实验组锦鲤采取人工注射不同浓度的嗜水气单胞菌,定期观察及记录实验鱼的临床症状和死亡情况。实验组临床症状主要表现为：鱼体表面均充血、变黑,有腐烂现象；鱼腹部膨胀,肛门红肿突出；解剖见病鱼腹腔积水,内脏有充血现象,肠壁周围有较多的淡黄色粘液；鱼鳔体积变大,鱼鳔壁有加厚现象,鱼鳃失血且苍白；对照组无任何不良症状和死亡记录。利用组织划线分离法,对实验组感病鱼体内细菌进行分离,直至获得纯培养。通过菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化反应分析、扫描电镜观察及16SrDNA序列鉴定,确定了引起实验组鱼发病的菌株为接种菌株,并可以从病、死鱼体内分离到实验菌株,显示该菌株对锦鲤有极强的致病作用。采用药敏纸片法对15种抗生素进行药敏试验,发现实验菌株对头孢氨苄、头孢噻吩、利福平、丁胺卡那、庆大霉素等药物有敏感作用。说明在当前渔业养殖中大规模应用抗生素的情况下,该菌株已具有一定的耐药性。模拟自然感染条件,在水族箱中直接加入实验菌株感染锦鲤,待实验鱼有发病症状出现后,分别取不同组织制备组织切片,再通过特异性探针与组织切片进行原位杂交,分析嗜水气单胞菌在各组织器官内的分布情况。结果显示：在锦鲤肌肉、肠、肾脏、肝脏、鳃、脑组织中均检测到嗜水气单胞菌；其中,在肝脏和肾脏组织中,阳性信号分布多,在感染程度较重,部分杂交信号呈紫黑色,且出现大块沉淀。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943

【参考文献】