亚甲基蓝在异育银鲫体内的代谢规律及对P-糖蛋白表达的影响

发布时间：2020-07-26 18:27

【摘要】：亚甲基蓝(methylene blue,MB),是一种常用的噻嗪类染料。它的去一甲基、去二甲基与去三甲基的代谢产物分别为天青B(azure B,AZB)、天青A(azure A,AZA)、天青C(azure C,AZC)。亚甲基蓝在水产上常用于水霉病的防治。然而,国外研究表明,亚甲基蓝及其代谢物具有生殖毒性和“三致”作用。其在水产动物中的蓄积残留会对非靶动物及人体存在潜在的危害。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一种跨膜蛋白,具有药物外排作用,对药物在机体内的作用影响重大。药物可以通过诱导或抑制P-糖蛋白的表达对另一种药物产生作用,药物因此疗效提高或者毒性降低。目前,国内外对亚甲基蓝在水产动物体内分布及消除规律的研究罕有报道,而且亚甲基蓝在不同动物体内代谢规律有差异。因此,本试验以异育银鲫为研究对象,采用高效液相色谱法对亚甲基蓝及其代谢物进行检测,探究亚甲基蓝及代谢物在水产动物体内的分布和消除规律;采用实时荧光定量法和免疫组织化学方法探究亚甲基蓝对P-糖蛋白表达的影响,探究药物与P-糖蛋白间的相互作用,为加强该药物的管理和应用提供理论依据。本论文的主要研究及结果如下:(1)本研究建立了异育银鲫成鱼和鱼苗体内亚甲基蓝及代谢物的检测方法。MB、AZB、AZA、AZC在0.010~1.0 mg/L范围内,线性关系良好,R20.9998,线性方程分别为y=0.3738x-0.4513,y=0.0442x-0.1672,y=0.0455x-1.1833,y=0.1124x-2.3458,检测限为2.0μg/kg,变异系数小于10%。(2)以15 mg/L的亚甲基蓝浸泡异育银鲫成鱼0.5 h后将其饲养于实验室水族箱中,研究了常规用药条件下亚甲基蓝及其代谢物在异育银鲫各组织中的分布及消除规律。采用高效液相色谱法检测亚甲基蓝及其代谢物在异育银鲫组织中的浓度,DAS3.0药物与统计软件对数据进行分析。结果表明:血液中亚甲基蓝、天青B、天青A达峰时间Tpeak分别为0.083、0.5和8h,峰浓度值Cmax分别为143.436、110.770和8.444μg/L。亚甲基蓝、天青B、天青A在异育银鲫4种组织中肝胰脏浓度最高,皮肤最低,肾脏含量高于肌肉,其中异育银鲫肌肉和皮肤组织易蓄积亚甲基蓝及代谢物,至64 d仍可以检测到,组织中未检测到天青C。(3)采用实时荧光定量法方法检测了MB对异育银鲫组织中P-糖蛋白m RNA表达的影响。结果表明,P-糖蛋白在肝脏的相对表达含量最高,皮肤组织次之,而在肾脏组织中最低。通过独立样本T检验得出,肝胰脏、肾脏和皮肤分别存在极显著性差异(P0.01)。由此可以推断,P-糖蛋白在异育银鲫组织中广泛存在,但在不同组织间的表达量有所差异。在基因水平上,药物代谢组与空白组P-糖蛋白的相对表达均具有极显著差异(P0.01)。在肝脏组织各代谢时间点的样品P-糖蛋白的表达均低于空白组织,而肾脏和皮肤组织未呈现出相似的规律。采用免疫组织化学的方法检测了MB对异育银鲫组织中P-糖蛋白表达的影响。由免疫组化结果可以看出,空白组织中,P-糖蛋白在肝脏的光密度值最高,皮肤组织略高于肾脏组织。通过独立样本T检验得出,空白肝脏与空白皮肤与空白肾脏组织分别存在极显著性差异(P0.01),而空白皮肤组织与空白肾脏组织光密度不存在显著性差异(P0.05)。由此可以推断,P-糖蛋白在异育银鲫不同组织中表达量有所不同,在肝脏中表达量较高。亚甲基蓝在药物代谢的过程中对P-糖蛋白在肝胰脏、肾脏和皮肤组织的表达产生了一定影响。综上,本文建立了同时检测水产品中亚甲基蓝及其3种代谢物的方法;亚甲基蓝及代谢物天青A和天青B在异育银鲫不同组织中达峰时间有差异,消除时间均较长,至64 d仍可以检测到,组织中未检测到天青C。P-糖蛋白在异育银鲫不同组织中表达量有所不同,在肝脏中表达量较高。亚甲基蓝在药物代谢的过程中对P-糖蛋白的表达产生了一定影响。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S948
【图文】：

超声提取 15 min，4500 r/min 离心 5 min，取乙腈层于另一 50 ml 离心管中，残留物中再加入 4 mL 乙腈，重复以上操作后合并乙腈层。提取物的净化：在离心管中加入 10 mL 乙睛饱和过的正己烷，剧烈振荡混合后，4500 r/min 离心 5 min，弃去正己烷层，加入 2 mL20%二甘醇，再加入 10 mL二氯甲烷，重复以上操作后取下层，40 ℃下旋转蒸发至近干，用流动相定容至 1.5mL，过 0.22 μm 滤膜后，待测。1.3 实验数据处理数据采用 Microsoft Excel 2010 计算并绘制标准曲线，进行回归分析。2 实验结果2.1 目标物质的色谱图目标物质的的保留时间分别为 6.728、5.380、4.34 和 4.08 左右（见图 1-1）。

参数 单位亚甲基蓝 methyleneblue天青 B azure B 天青 AazureAParameters Unit肌肉muscle皮肤skin肌肉muscle皮肤skin肌肉muscle皮肤skinAUC(0-t)μg h/ kg 55006.41 38475.585 108478.83 73501.785 43213.005 30831.195AUC(0-∞)μg h/ kg 79114.14 96916.695 167717.4 135907.305 92704.815 39620.13MRT(0-t)h 679.713 783.438 703.753 807.729 776.881 831.021MRT(0-∞)h 1273.645 2387.955 1469.182 2164.351 2378.998 1236.727t1/2z h 757.321 1322.46 925.051 1542.751 1553.609 778.879Tmax h 192 4 0.083 4 768 4CLz/Fh kg/L 0.284 0.232 0.134 0.166 0.243 0.568Cmax μg/kg 76.450 63.468 130.100 121.470 45.297 31.031注: 同表 2-1Notes:The same with Tab.2-1

上海海洋大学硕士学位论文荧光定量 PCR 结果可以看出，在三组未用药空白组织中，P-糖蛋白在肝表达含量最高，皮肤组织次之，而在肾脏组织中最低（见图 3-1）。T 检肝胰脏、肾脏和皮肤间存在极显著性差异(P<0.01)。由此可以推断，P-糖育银鲫组织中广泛存在，但在不同组织间的表达量有所差异。结果 异育银鲫组织中 P-糖蛋白在 mRNA 水平的表达

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本文编号：2771132