锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增可视化检测方法的建立

发布时间：2020-07-26 19:17

【摘要】：锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease,KHVD)是危害养殖鲤最为严重的病毒性疾病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的疾病,我国将其列为二类动物疫病。KHV具有高度传染性,毒力强,感染锦鲤、鲤及其普通变种。目前KHV的检测方法大都需要昂贵的仪器设备,且操作复杂,需要专业技术人员操作,不能满足现场快速诊断的要求。因此,目前亟需建立一种操作简单、结果准确可靠、结果判定直观、成本低廉的现场快速检测方法,为疾病的防控提供技术支撑。本论文对锦鲤疱疹病毒病的国内外流行现状、检测方法以及交叉引物技术的原理和应用等进行了阐述,研究与建立了一种与胶体金标记的核酸快速检测试纸条相结合的锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增的可视化检测方法。本论文研究的主要内容如下:1.引物设计及病毒DNA重组质粒的构建。根据锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(DNA polymerase,Sph)基因,设计了一组单交叉扩增引物,包括交叉引物2a1s,探针引物2a(2a-Bio)、3a(3a-FIT),剥离引物4s、5a。利用锦鲤鳍条组织细胞系Koi-Fin培养增殖KHV,提取病毒基因组DNA。以4s、5a为引物和KHV基因组DNA为模板扩增KHV Sph基因的部分片段,然后将该基因片段克隆连接p MD#174;-19T载体构建重组质粒p MD#174;-19T-Sph,作为后续实验的标准DNA模板。2.建立交叉引物等温扩增(cross priming amplification,CPA)的基础反应体系及反应条件,并对其进行了优化,最终建立了KHV单交叉引物等温扩增(single cross priming amplification,SCPA)KHV-SCPA方法。本实验依次优化了引物浓度比例、Mg2+浓度、d NTPs浓度、Betaine浓度、Bst DNA聚合酶用量以及反应温度和扩增时间。最佳反应体系各成分终浓度为:1×Thermo Pol#174;Reaction Buffer,交叉引物2a1s 1.0μmol/L,探针引物2a(2a-Bio)、3a(3a-FIT)各0.5μmol/L,剥离引物4s、5a各0.6μmol/L,Mg2+浓度8.0 mmol/L,d NTPs浓度1.2 mmol/L,Betaine浓度0.7 mol/L,Bst DNA聚合酶用量5.6 U,模板DNA 1μL,无核酸酶水补足至25μL。最佳反应温度为63℃,最佳扩增时间为60 min,扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带。3.KHV-SCPA特异性检测及灵敏度测定。提取锦鲤疱疹病毒KHV、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)、鳗鲡疱疹病毒(Ang HV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)、白斑综合征病毒(WSSV)以及细菌病原嗜水气单胞菌(Ah)基因组DNA,进行特异性检测实验,结果表明,KHV-SCPA检测方法可特异性检测出KHV。将常规PCR的检测灵敏度与本研究建立的KHV-SCPA检测灵敏度进行比较,结果表明,KHV-SCPA检测方法灵敏度较之常规PCR法高出约1 000倍。与胶体金标记的核酸快速检测试纸条相结合,在3~5 min内可对等温扩增反应产物进行可视化检测。综上所述,本研究建立的KHV-SCPA检测方法可在63℃下60 min内实现DNA扩增,特异性地检测出KHV,灵敏度较之常规PCR方法高出约1 000倍。结合核酸试纸条检测技术,在3~5 min内可对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【图文】：

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上海海洋大学硕士学位论文检测试纸条、一次性核酸检测装置等）结合，可为现场快速检测提供一个平台，在分子诊断、检验检疫、生物医学等研究领域得到了广泛的应用。

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11图 1-2 双交叉引物扩增技术原理图Fig.1-2 The mechanism schematic of double crossing CPA reactiona选自文献（Xu et al.,2012）2.1.1 交叉引物等温扩增（CPA）技术的扩增原理CPA 扩增体系包括交叉引物、特异引物（探针标记后即为检测引物）以及 Bs（Bacillus stearothermophilus）DNA 聚合酶，Bst DNA 聚合酶的链置换功能使得DNA 的连续循环扩增得以实现。CPA 扩增的主要步骤如下：1. 带有交叉引物位点的扩增产物的产生。正向交叉引物的 5’端与反向交叉引物的杂交识别序列相同。特异引物分别位于交叉引物的上游。特异引物的浓度低

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光染料法中添加嵌入荧光染料（溴化乙锭、SYBR GreenⅠ光染料只与双链 DNA 小沟结合，当有扩增产物生观察荧光染料颜色由原来的橘黄色变为绿色。检测法膜层快速检测试纸条以及一次性核酸检测装置等条结果。仅出现一条红线（在质控区 C）时，判断现两条红线：一条位于检测区（T），另一条位于，即有反应发生；如果无红线出现，则说明检测

【参考文献】