岩扇贝高通量转录组文库测序和分子标记开发

发布时间：2020-07-28 22:14

【摘要】：岩扇贝(Crassadoma gigantea,Rock scallop)隶属于软体动物门、双壳纲(Bivalvia)、扇贝目、扇贝科,最早发现于北美太平洋沿岸地区,因具有个体大、生长速度快、抗逆性强、肉嫩味美等优点,在国际市场备受青睐。为有效缓解国内扇贝养殖品种少、病害频发、产量低、死亡率高等问题,岩扇贝作为优良品种于2012年被引进我国。目前,国内外对岩扇贝分子遗传学的研究较少。因此,本研究采用高通量转录组测序的方法和RNA-Seq技术对岩扇贝闭壳肌、鳃、外套膜及内脏团的DNA混合物进行转录组文库测序和分析。利用获得转录组数据开发岩扇贝微卫星分子标记,为其遗传多样性分析和分子遗传学研究奠定基础。1.通过Illumina总共得到80,832,518条原始读段,去除低质量序列、rRNA和接头序列后,得到77,306,198条(95.64%)干净读段。利用这些读段进行组装,共获得到了158,855条转录本和96007条unigenes。利用生物信息学软件,从转录组数据库19182条序列中获得24795个微卫星位点,其中每条序列包含微卫星位点大于1的序列数量为4148,占比21.6%。二碱基重复5602个,三碱基重复1924个,四碱基重复186个,分别占微卫星序列总数的22.6%,7.8%和0.8%。从中选取97对微卫星序列设计引物,42个引物扩增出目的产物,利用30个岩扇贝个体检测微卫星的多态性,其中12个证明是有多态性的位点。进一步分析结果显示等位基因数从3到9不等,平均为3.25个等位基因;观测杂合度和期望杂合度分别为0.033~0.923和0.254~0.820,其中2个微卫星位点显著偏离哈迪温伯格平衡(PHWE0.01)。2.本文采用PCR扩增和序列测定等技术,对岩扇贝线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段进行了初步研究,得到16S rRNA基因片段的大小在613bp-634bp之间,A,T,G,C的平均含量分别为26.5%,29.7%,24.5%和19.3%。COI基因片段的大小为660bp,碱基A,T,G,C的平均含量分别为17%,40%,27%和15%。16S在岩扇贝中扩增偏向使用以U或G结尾的密码子,总使用度分别为12.76和8.02。其中GUU的同义密码子使用度大于2,为16S在岩扇贝中偏好行使用次数最多的。COI系统进化树表明与岩扇贝亲缘关系最近的是栉孔扇贝Azumapecten farreri,其次是Chlamys islandica。16S系统进化树亲缘关系由近到远依次是Patinopecten caurinus,Mizuhopecten yessoensis,Chlamys islandica。转录组测序平台展示了对岩扇贝物种快速开发分子资源的能力。这些新的多态性微卫星标记对进一步的种群研究和保护遗传学提供基础资料。
【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

外部特征,扇贝

人们生活水平显著提高，对海产品的需求量增大，因此大多数人们选定到味道鲜美且富含高蛋白和氨基酸的贝类上。然而自然生长的贝类产量并种供不应求的局面刺激下，大部分地区的养殖海区对栉孔扇贝 (Chlamys farr贝 (Patiopecten yesoensis)、海湾扇贝 (Argopecten irradians)等经济种类进行了密度养殖，从而引发了一系列问题:扇贝种质退化、成贝产品规格较小，肉柱率病大面积死亡等，使得整个贝类养殖业经济效益下降。这些问题都直接或间接国贝类养殖业的发展。

扇贝,内部构造

流程图,样品制备,测序,流程图

释文库至 1.5ng/μl，随后使用 Agilent 2100 对文库的 insert size 进行检测，insert size 符合期后，使用 Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求 pooling 后行 Illumina HiSeq 测序。1.3 转录组生物信息分析流程测序得到的原始读段（双末端序列）进行数据评估、过滤，然后组装得到该物种的igene 文库，再利用 unigene 序列进行基因结构注释、表达分析和功能注释等。转录组物信息分析流程如图 2-1，2-2：

【参考文献】