中国对虾免疫致敏（类免疫）反应的诱导及其分子机制初探

发布时间：2020-08-01 11:06

【摘要】：本实验选取中国对虾新品种“黄海2号”为实验对象,以干热、60Coγ射线和双乙烯亚胺(binary ethyleneimine,BEI)灭活的白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)为媒介,诱导中国对虾产生免疫致敏(immune priming)反应;并分析比较不同诱导方式对二次感染WSSV后对虾死亡率、平均存活时间及相对免疫保护率的影响,并分析了可能与免疫致敏反应相关的FcDscam基因在组织和时空上的变化规律,以期探究中国对虾免疫致敏反应的发生机制,为对虾疾病的预防探寻新的方法。具体研究内容如下:本实验拟探究经热灭活的WSSV能否诱导中国对虾产生免疫致敏反应。实验将患有典型白斑综合征症状的对虾取腹部肌肉剁碎后经60℃灭活1 h,采用单尾定量口饲的方法,连续6 d投喂不同水温条件(15℃、23℃、28℃、32℃)下的实验组对虾(E15℃、E23℃、E28℃、E32℃);同时设置常温(23℃)条件下阳性对照组C23℃(投喂未经灭活的WSSV毒饵)、对照组CF23℃(只投喂商业配合饲料)。在实验第13d对存活个体进行第二次人工WSSV感染,结果显示,WSSV经60℃处理1 h可彻底失活,表现为连续投喂6天至第二次人工感染期间无对虾死亡,而阳性对照组C23℃死亡率为100%。截止实验第19 d,E15℃、E23℃、E28℃、E32℃各组存活率分别为80.41%、33.29%、8.47%、16.43%,CF23℃组的存活率为8.89%,E15℃组与其它各实验组差异极显著(P0.01),E23℃与CF23℃、E28℃、E32℃组差异显著(P0.05),E28℃和E32℃组差异不显著(P0.05);对各组实验材料进行WSSV绝对荧光定量检测,结果显示,经热灭活WSSV诱导的中国对虾二次感染WSSV后,28℃环境下病毒的增殖速度最快,高温(32℃)和低温(15℃)都会不同程度抑制WSSV的增殖速率。实验证明,热灭活WSSV可以诱导中国对虾产生免疫致敏反应,对感染WSSV后的中国对虾具有一定的保护作用;温度与WSSV的增殖速率密切相关。通过同源克隆和RACE技术获得了中国对虾(F.chinensis)Dscam基因cDNA序列全长,并对该序列进行生物信息学分析。结果显示,中国对虾Dscam基因全长6624 bp,其中包括171 bp的5’端非编码区(5’UTR),459 bp的3’端非编码区(3’UTR);开放阅读框(ORF)的长度为5994 bp,共编码1997个氨基酸,命名为FcDscam。该基因编码的蛋白含有一个信号肽(signal peptide)、10个Ig(immunoglobulin,Ig)结构域,6个FNIII(fibronectin type III,FNIII)功能区,1个胞质尾区(cytoplasmic tail),1个跨膜结构域(transmembrane domain)。经同源比对和系统进化树分析,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)与中国对虾的相似性最高,为92.4%,在系统进化树中,先与凡纳滨对虾聚为一支,然后同其它几种甲壳动物红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)、通讯螯虾(Pacifastacus leniusculus)、普通滨蟹(Carcinus maenas)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)聚为一大支。连续投喂6 d热灭活WSSV饵料诱导免疫致敏反应,在0 d,6 d,12 d及二次感染后12 h,24 h,48h,72 h,168 h分别取样,用RT-PCR的方法检测FcDscam相对表达量。结果显示,FcDscam基因在第12 d开始上调,与对照组差异显著(P0.05);二次感染后24 h,相对表达量达到最大值,与对照组差异极显著(P0.01);48 h后基因表达量开始下降。实验表明,中国对虾存在Dscam基因,并在免疫致敏过程中发挥重要作用。为了探究如何有效的诱导对虾等无脊椎动物的免疫致敏反应,实验通过物理方法60Coγ辐照灭活患典型白斑综合征的对虾肌肉,连续10 d投喂灭活的WSSV饵料;使用化学试剂双乙烯亚胺灭活白斑综合征病毒悬液,在实验第1 d和6 d注射灭活的WSSV病毒悬液,10 d后将诱导存活的个体均分为注射感染组和口饲感染组,并分别设置阳性对照和阴性对照,分别进行二次感染。二次感染7 d,γ-射线诱导组相对免疫保护率为20.94%(口饲)和13.64%(注射);BEI灭活诱导组相对免疫保护率为45.23%(口饲)和11.11%(注射)。在免疫诱导阶段,0 d,3 d,6 d和10 d及二次感染后0 h(10 d),6 h,12 h,24 h,48 h取BEI灭活组样品,通过实时荧光定量PCR分析Dscam基因时空和组织表达特征。结果发现,BEI第一次注射诱导后3 d,血淋巴中Dscam基因相对表达量开始上调,在第10 d达到诱导阶段的最大值,与WSSV感染组和PBS组差异显著(P0.05)。二次注射和饲喂感染后,血淋巴中Dscam基因的表达量一直维持在较高水平,显著高于对照组(P0.05)。且两种感染方式下存活个体Dscam基因的相对表达量达到最大值。综上所述,γ-射线和BEI都可以有效的灭活WSSV,并且可以诱导免疫致敏反应的发生,且这种免疫保护对饲喂和注射感染都有效。Dscam可以被灭活的WSSV诱导上调,这说明Dscam可能与免疫致敏密切相关。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S945.4
【图文】：

结构示意图,无脊椎动物,模式识别受体,免疫功能

protein)和 Toll 样受体，这些模式识别受体在研究中都被发现具有特异性的结合特性和免疫功能。图1-1 几种IgSF类分子结构示意图[56]Fig.1-1 The molecular structure of several kinds of IgSF5.2 类免疫球蛋白的发现无脊椎动物被认为不能产生免疫球蛋白，但是近年来的研究证实无脊椎动物体内存在免疫球蛋白超家族分子。章跃陵等在日本囊对虾和凡纳滨对虾的血清中

免疫球蛋白,脊椎动物,差异比较

图 1-2 Dscam 与脊椎动物免疫球蛋白的差异比较[67]Fig.1-2 The compare of formation between Dscam and immunoglobulin in vertebrateam 基因的可变剪切物的进化过程中，为了适应复杂多变的环境，生物体进化出了在有限得到结构复杂性和生理复杂性的机制，蛋白质的多样性可以通过许调节，可变剪切是一个主要的调节机制(或选择性剪接， altern)[68]，除此之外的调节机制还有基因组多样性（基因家族）、外显子重排(g)、体细胞高频突变(somatic hypermutation)和体细胞基因外显子重排等样性的产生机制可能是无脊椎动物产生免疫致敏的先决条件。有些mRNA 前体可以通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不剪接异构体（图 1-3），可变剪切是导致真核生物基因和蛋白质数量较原因。有研究表明，70%RNA 前体都有通过可变剪切产生复杂 mRN[69]。在脊椎动物的免疫防御系统中，T 细胞的激活和 T 细胞内稳态

示意图,剪切机,示意图

上海海洋大学硕士学位论文没有充足的研究来证明。仅有研究证明与 mRNA 形成和成熟有关的丝富集蛋白 B52 的沉默降低了 Dscam 基因 Ig7 区域的可变性，B52 基因scam 等基因的可变剪切，作为一个可变剪切的正向调控基因来规范可动[71]。无脊椎动物受到不同病原体刺激形成不同 Dscam 亚型的机制是目前的研究还非常少，我们还需要更多的研究来了解 Dscam 是如何与、其吞噬作用和特异性识别的机理、表达动力学以及如何形成多变的亚

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