基于脑转录组数据筛选尼罗罗非鱼基因-温度性别决定相关基因的研究
发布时间：2020-08-03 05:40
【摘要】：脊椎动物的性别决定类型可分为遗传性别决定(GSD)、环境性别决定(ESD)、遗传与环境性别决定(GSD+ESD)三大类。在各种环境因素中,温度对性别决定的影响因素最大所以称为温度性别决定(TSD)。有些鱼类的性别决定受遗传和温度的双重调控,被称为遗传性别决定和温度性别决定的混合型(GSD+TSD),如尼罗罗非鱼就是一种GSD+TSD鱼类。前人已发现高温能影响性腺中许多雌性性别分化相关基因如Cyp19a1a和雄性性别分化相关基因如Dmrt1等的表达,然而,很少有研究在热敏期(TSP)期间进行温度处理对脑中的相关基因表达的影响。因此,本试验中首次利用尼罗罗非鱼脑组织进行转录组测序来揭示在性别分化关键期尼罗罗非鱼高温性逆转过程中脑中的基因表达变化。本研究建立了三个全雌家系(F1-F3),三个全雌家系高温处理后的雄性率分别为65%(F1)、74%(F2)和87%(F3)。从上述3个家系中挑选高温处理后雄性率最高的F3家系,在21 dpf时,取F3家系中对照雌鱼组(FC)和高温处理组(FT)的脑组织用于转录组分析。同时建立了1个正常家系,在21dpf时,采用分子标记技术鉴定幼鱼的雌雄,选取雄性个体的脑组织作为对照雄鱼组(MC)用于转录组分析。高通量分析结果显示FC、FT和MC三组共获得351,146,876个clean reads。三组之间两两比较,结果显示:在FC/FT、FC/MC和MC/FT比较组中分别获得的差异表达基因(DEG)数目为:105、3164和4666个,其中FC/FT组中上调的DEG有87个,下调的DEG有18个;FC/MC组中上调的DEG有1123个,下调的DEG有2041个;MC/FT组中上调的DEG有3354个,下调的DEG有1312个。Venn图显示FC/FT和FC/MC、FC/FT和MC/FT、FC/MC和MC/FT重叠的DEG数目分别为31、88和2534个。此外,本试验通过GO、KEGG和趋势分析对各比较组的DEG进行进一步分析与筛选。其中GO分析表明DEG主要涉及参与了单生物过程(Single-organism Process)、代谢过程(Metabolic Process)、细胞过程(Cellular Process)和结合(Binding)等生物学功能。大多数的DEG主要富集在细胞粘附因子(Cell adhesion molecules)、代谢通路(Metabolic pathways)、抗生素的生物合成(Biosynthesis of antibiotics)等生物学通路中。通过趋势分析共筛选出16个DEG,其mRNA表达水平在高温处理后表现出显著的下调或上调,并达到与MC相似的水平。在这16个DEG中,LOC100699848(lysine specific demethylase 6A)和Jarid2都含有JmjC结构域,表明JmjC结构域可能在尼罗罗非鱼进行温度处理的过程中起着重要的作用。最后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对9个差异表达基因进行验证。本研究结果将为研究鱼类GSD+TSD的分子机制提供重要的线索。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：
图 1 RNA-seq 的试验设计Fig. 1 Experimental design of RNA-seq in this study.遗传上全雌家系的受精卵在 28℃下培养，当孵出的幼鱼可以自由游动时(约 9 天后),将受精卵一分为C 组，受精卵和幼鱼总是在 28℃下培养。对于 FT 组，将可以自由游动（热敏期，TSP）的幼鱼施加36℃高温处理并持续 12 天。在 TSP 末端（21dpf）对 FC 和 FT 组进行了全脑取样。fter the fertilized eggs from a genetically all-female family were cultivated at 28 °C for about 9 days, thearvae can swim freely. For FC group, the fertilized eggs and larvae were always cultured at 28 °C. For FT 36 °C high temperature treatment was applied from just freely swimming larvae and lasted for 12 daysensitive Period, TSP). Before the high temperature treatment, the fertilized eggs and larvae were reared at28 °C. We collected isolated whole brain samples at the end of TSP from FC and FT group.仪器与试剂机：美国 Minitowac S-150；机：德国 Sigma 公司；离心机：德国 Sigma 公司；荧光定量 PCR 仪：美国 ABI 7500 PCR 仪；
Oligo（dT）的磁珠富集 mRNA，向得到的 mRNA 中加入 fragmentati为短片段，再以片断化的mRNA为模板，用六碱基随机引物（random h 第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成过 QiaQuick PCR 试剂盒纯化并加 EB 缓冲液洗脱经末端修复、加碱再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行 PCR 扩增，从而完作，构建好的文库用 Illumina HiSeqTM进行测序。Seq 生物信息学分析数据进行过滤后，得到 clean data，将其比对到选定的尼罗罗非鱼参考 Cufflinks 对转录本进行组装，共产生两个转录本：已知的转录本和新已知转录本中所包含的的基因进行表达量分析与统计，并进行差异表分析。另外，通过基因结构优化、可变剪切等对基因进行结构分析
山东农业大学硕士专业学位论文 雌性对照组（28℃）；B：XY 雄性对照组（28℃）；C：高温处理组未发生性逆转的 XX 雌性（36℃理组发生性逆转的 XX 伪雄鱼（36℃）；PVO：卵黄发生前期的卵母细胞；SG：精原细胞；SP：精母SZ：精子。Fig. 3 The histological analysis of gonad.X females in control group reared at 28 °C; B: XY males reared at 28 °C; C: XX females in high temperaturegroup reared at 36 °C; D: XX neomales in high temperature treated group reared at 36 °C; PVO = oocytes at tpre-vitellogenic stage; SG = spermatogonium; SP = spermatocyte; SZ = spermatozoa;通过组织学检测，经过高温处理后三个全雌家系的雄性比例分别为（图 4）：）、74％（F2）、87％（F3）。然而，经过高温处理后，仍有一小部分个体没为雄性。为了消除 FT 组中未发生性逆转的个体所带来的误差，选用高温处理最高的全雌家系（F3）两组鱼作为 FC 和 FT 组用于转录组分析，每组设置三重复，每个重复包含 10 尾鱼的脑组织。
本文编号：2779198
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：
图 1 RNA-seq 的试验设计Fig. 1 Experimental design of RNA-seq in this study.遗传上全雌家系的受精卵在 28℃下培养，当孵出的幼鱼可以自由游动时(约 9 天后),将受精卵一分为C 组，受精卵和幼鱼总是在 28℃下培养。对于 FT 组，将可以自由游动（热敏期，TSP）的幼鱼施加36℃高温处理并持续 12 天。在 TSP 末端（21dpf）对 FC 和 FT 组进行了全脑取样。fter the fertilized eggs from a genetically all-female family were cultivated at 28 °C for about 9 days, thearvae can swim freely. For FC group, the fertilized eggs and larvae were always cultured at 28 °C. For FT 36 °C high temperature treatment was applied from just freely swimming larvae and lasted for 12 daysensitive Period, TSP). Before the high temperature treatment, the fertilized eggs and larvae were reared at28 °C. We collected isolated whole brain samples at the end of TSP from FC and FT group.仪器与试剂机：美国 Minitowac S-150；机：德国 Sigma 公司；离心机：德国 Sigma 公司；荧光定量 PCR 仪：美国 ABI 7500 PCR 仪；
Oligo（dT）的磁珠富集 mRNA，向得到的 mRNA 中加入 fragmentati为短片段，再以片断化的mRNA为模板，用六碱基随机引物（random h 第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成过 QiaQuick PCR 试剂盒纯化并加 EB 缓冲液洗脱经末端修复、加碱再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行 PCR 扩增，从而完作，构建好的文库用 Illumina HiSeqTM进行测序。Seq 生物信息学分析数据进行过滤后，得到 clean data，将其比对到选定的尼罗罗非鱼参考 Cufflinks 对转录本进行组装，共产生两个转录本：已知的转录本和新已知转录本中所包含的的基因进行表达量分析与统计，并进行差异表分析。另外，通过基因结构优化、可变剪切等对基因进行结构分析
山东农业大学硕士专业学位论文 雌性对照组（28℃）；B：XY 雄性对照组（28℃）；C：高温处理组未发生性逆转的 XX 雌性（36℃理组发生性逆转的 XX 伪雄鱼（36℃）；PVO：卵黄发生前期的卵母细胞；SG：精原细胞；SP：精母SZ：精子。Fig. 3 The histological analysis of gonad.X females in control group reared at 28 °C; B: XY males reared at 28 °C; C: XX females in high temperaturegroup reared at 36 °C; D: XX neomales in high temperature treated group reared at 36 °C; PVO = oocytes at tpre-vitellogenic stage; SG = spermatogonium; SP = spermatocyte; SZ = spermatozoa;通过组织学检测，经过高温处理后三个全雌家系的雄性比例分别为（图 4）：）、74％（F2）、87％（F3）。然而，经过高温处理后，仍有一小部分个体没为雄性。为了消除 FT 组中未发生性逆转的个体所带来的误差，选用高温处理最高的全雌家系（F3）两组鱼作为 FC 和 FT 组用于转录组分析，每组设置三重复，每个重复包含 10 尾鱼的脑组织。
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 尚晓莉;曲宪成;;鱼类性别决定和性别分化机制研究进展[J];江苏农业科学;2010年04期
2 孙丽叶;陈彪;;基因决定脑的性别分化[J];中华行为医学与脑科学杂志;2009年03期
本文编号：2779198
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/2779198.html
