替普瑞酮对花鲈肠道缺氧应激的损伤防护研究

发布时间：2020-08-03 10:09

【摘要】：替普瑞酮(Teprenone或Geranylgeranylacetone)作为一类安全、高效的胃肠黏膜保护剂,在人类和畜禽中已有相关研究报道,但其在水产动物中的研究还较少。本研究以中国南方重要的经济鱼类品种花鲈(Lateolabrax maculatus)为研究对象,经预投喂替普瑞酮,研究其对花鲈肠道缺氧应激的损伤防护作用,进一步结合花鲈肠道组织形态、肠道菌群组成、氧化应激相关因子、非特异性免疫、细胞凋亡相关因子活性及其相关基因表达情况分析,以探究替普瑞酮对花鲈肠道缺氧应激的保护作用机理。具体研究结果如下:1.研究了替普瑞酮对周期性缺氧应激花鲈肠道组织形态的影响。研究发现,长期周期性缺氧应激引起花鲈肠道绒毛长度降低,肠上皮细胞脱落,替普瑞酮处理组(HT200,HT400和HT800组,以下称HT组)肠道绒毛长度、绒毛宽度和肌肉层厚度之间无显著差异(P0.05),且与常氧对照组(NC组)差异不显著(P0.05)。与缺氧对照组(HC组)相比,HT组肠道组织结构较为完整,无明显上皮细胞脱落情况。结果表明,预先拌喂不同浓度替普瑞酮能维护周期性缺氧应激花鲈肠道组织结构稳态。2.基于Illumina MiSeq高通量测序技术,分析了替普瑞酮对周期性缺氧应激花鲈肠道菌群结构的影响。研究发现,周期性缺氧导致花鲈肠道菌群多样性和丰富度显著增加,群落结构复杂化。缺氧对照组(HC组)肠道菌群分类操作单元(operational taxonomic units,OTUs)显著增高,其特有OTUs数达334个,与其他组存在较大差异。在门的分类水平上,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为各组肠道菌群主要组成菌门。与NC组相比,HC组变形菌门相对丰度显著降低(P0.05),拟杆菌门的相对丰度显著升高(P0.05),HT组花鲈肠道菌门组成与NC组无显著差异(P0.05)。在纲水平上,HC组α变形菌纲(Alphaproteobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)相对丰度显著降低(P0.05),梭菌纲(Clostridia)、γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)和拟杆菌纲(Bacteroidia)相对丰度显著升高(P0.05)。HT400组α变形菌纲相对丰度介于NC组和HC组之间,梭菌纲、γ变形菌纲和芽孢杆菌纲相对丰度与NC组差异不显著(P0.05)。此外,周期性缺氧应激还引起花鲈肠道内厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)等厌氧或兼性厌氧菌和绿硫菌科(Chlorobiaceae)等光合产氧菌类相对丰度升高。结果表明,缺氧导致花鲈肠道菌群群落结构复杂化,有益菌种(如α变形菌纲)相对丰度降低,条件致病菌(如拟杆菌纲)相对丰度升高,400mg/kg替普瑞酮投喂对于维护周期性缺氧应激花鲈肠道组织菌群稳态具有良好作用。3.通过免疫相关酶活与细胞凋亡相关蛋白和基因表达情况分析,探究替普瑞酮对花鲈肠道周期性缺氧应激的损伤防护作用机理。(1)氧化应激相关指标分析发现,HC组超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量显著升高(P0.05),总抗氧化能力(T-AOC)显著低于NC组(P0.05)。HT200和HT400组抗氧化酶活性和MDA含量介于HC和NC组之间。(2)非特异性免疫相关指标分析发现,HC组溶菌酶(LZM)活性最低,且与NC组差异显著(P0.05)。HT200组LZM活性显著高于HC组(P0.05)。热休克蛋白70(HSP70)含量及基因相对表达量在NC组、HT200和HT400组较高,在HC组和HT800组较低。HC组HSP90 mRNA相对表达水平显著低于其他组(P0.05),HT200和HT400组HSP90基因相对表达水平略低于NC组,两组之间无显著性差异(P0.05)。(3)细胞凋亡相关因子活性及其基因表达情况分析发现,HC组细胞色素C(Cyt-C)含量,caspase3活性和caspase9 mRNA表达水平显著高于NC组(P0.05),Bcl-2 mRNA表达水平显著低于NC组(P0.05)。HT组caspase9活性和基因表达水平接近于NC组。HT400组caspase3活性最低,与NC组差异不显著(P0.05)。HT组Bcl-2 mRNA表达水平与NC组差异不显著(P0.05)。结果表明,周期性低氧可以引起肠道组织的氧化应激,降低其非特异性免疫水平,诱导细胞凋亡的发生。替普瑞酮可在一定程度保护肠道组织,降低其氧化应激损伤,增强非特异性免疫酶活性及相关蛋白表达,抑制细胞凋亡因子活性及基因表达。4.在此基础上,进一步研究了替普瑞酮对花鲈肠道急性缺氧应激的损伤防护作用机理。(1)氧化应激相关指标分析发现,缺氧对照组(以下称Control组)SOD活性在各个时间点与400mg/kg替普瑞酮处理组(以下称Teprenone组)差异不显著(P0.05);CAT活性在0h显著高于Teprenone组(P0.05);T-AOC在6,12,24和48h时间点均显著高于Teprenone组(P0.05);MDA含量在B和12h时间点显著高于Teprenone组(P0.05)。(2)非特异性免疫相关指标分析发现,除12h时间点外,Control组LZM活性均低于Teprenone组,其中6和48h两组差异显著(P0.05)。与B时间点相比,0h时Control组HSP70含量有较大幅度升高。在0-48h,Control组HSP70含量呈逐渐降低趋势,且均高于Teprenone组。(3)细胞凋亡相关因子活性分析发现,Cyt-C,caspase9和caspase3活性在两组均呈先升高后降低的趋势。Control组Cyt-C含量在3h和48h显著高于Teprenone组(P0.05),caspase9和caspase3活性在B-48h均高于Teprenone组。结果表明,急性缺氧应激导致花鲈肠道氧化应激和细胞凋亡相关因子表达水平在0-12h内呈逐渐升高的趋势,在12-48h内逐渐降低;非特异性免疫水平在0-48h呈先降低后升高的趋势;400mg/kg替普瑞酮预投喂可在一定程度保护肠道组织,在急性缺氧后0-48h内,可有效防护肠道氧化应激和细胞凋亡,增强非特异性免疫能力。实验结果表明,缺氧对花鲈肠道组织产生应激损伤,影响肠组织形态与肠道菌群结构,替普瑞酮对其应激损伤具有一定保护作用。其中,拌喂400mg/kg替普瑞酮对花鲈肠组织形态及菌群稳态的维持具有较好的效果,可降低周期性及急性缺氧应激所引起的氧化损伤,增强非特异性免疫酶活性及相关蛋白表达,抑制细胞凋亡因子活性及基因表达,从而起到肠道应激损伤防护功能。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S948
【图文】：

中肠组织,菌群,鱼类肠道

图 1 中肠组织结构观察（H.E 染色）[13]Fig.1 Midgut histology（H.E staining）10：中肠横切；11：中肠肠绒毛横切；12：中肠肌层横切GC：杯状细胞（Goblet cell）；SEC：单层柱状上皮（Simple epithelium columnar）；BB：纹状缘（Brush border）；LP：固有膜（Lamina propria）；S：浆膜（Serosa）；CSM：环肌（Circularmuscle）；LSM：纵肌（Longitudinal muscle）；SM：黏膜下层（Submucosa）3.2 鱼类肠道菌群与功能动物肠道内寄生着大量微生物，该“微生物组(microbiome)”如同宿主的额外“器官”，行使着宿主自身没有的一些重要功能。在鱼类生长发育初始阶段，水体微生物可能为肠道优势菌的重要来源[22-23]。鱼类肠道菌群是一个由好氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌共同组成的动态菌群。这种特殊动态菌群环境，被称作肠道“岛屿”微生物群落。肠道微生态平衡是鱼体肠道健康的保证，而微生态的平衡需要多种肠道有益菌的维持[24]。正常情况下，鱼类肠道的各种微生物生长良好，占主导优势的有益微生物菌群如变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等菌群[25]一方面提供外源性消

实验装置,结构示意图,溶氧,饲料

HT400 和 HT800 组水体溶氧水平每天分为持为 6.0±0.2 mg·L-1；阶段 2：0:00-0:30，DO g·L-1；阶段 3：0:30-2:30，DO 维持在 2.5±0.2.5±0.2 mg·L-1逐渐恢复至 6.0±0.2 mg·L-1。周期组实验鱼除溶氧及投喂饲料外，其他日常管理市售鲈鱼专用配合饲料。实验饲料为将基础、800 mg/kg 比例添加替普瑞酮（卫材（中国）阴干，备用。的检测和调整，采用吴鑫杰[117]的方法并稍加其基本原理是以实时监控装置检测水体溶氧，水平，并通过控制气体充入速率精确溶氧控促进水体流动，保证养殖桶中各个部分水体

肠上皮细胞,肌肉层,杯状细胞,花鲈

上海海洋大学硕士学位论文HC 组完整，肠壁由内向外分层清晰，肠上皮细胞紧密连接，未见到明显的上皮胞脱落；肠绒毛形态完整、致密；杯状细胞分布致密，排列整齐。HT200, HT4和 HT800 组（以下并称 HT 组）肠上皮细胞脱落的情况明显较 HC 组减少，肠毛排列较为整齐。比较各处理组绒毛长度、绒毛宽度和肌肉层厚度发现，各组毛长度具有一定差异性，HC 组绒毛长度显著低于 NC 组和 HT 组（P＜0.05），H组与 NC 组无显著差异（P＞0.05），HT 组间无显著差异（P＞0.05）（图 2-3）。

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