凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症弧菌江苏株的分子分型及其拮抗菌筛选

发布时间：2020-08-06 15:26

【摘要】：急性肝胰腺坏死合综合症(Acute hepatopancreas necrosis syndrome,AHPNS)是近年来影响凡纳滨对虾养殖业发展的重要疾病之一。2009年以来,AHPNS使得亚洲对虾产量大幅下降,给亚洲养虾业带来了巨大的经济损失,我国以凡纳滨对虾养殖为主的对虾养殖业亦受到较大冲击。2013年,全球水产养殖联盟(Global Aquaculture Alliance,GAA)发表声明,明确了AHPNS的病原体是副溶血弧菌。据报道,该病原菌通过效应蛋白PirA与PirB产生毒力,病虾消化器官颜色苍白,肝胰腺萎缩,空肠空胃,发病1~3天内死亡率可达到100%。目前对于AHPNS的致病机理尚未研究清楚,尚无有效的防治手段见诸报道。本文通过分离得到了不同来源的凡纳滨对虾AHPNS致病菌,进行了分子分型,获得江苏地区急性肝胰腺坏死综合症的分子流行病学资料;通过致病性弧菌拮抗菌的筛选相关研究,为该病的生态防控提供技术资料。2017~2018年间,江苏省沿海地区连云港、盐城和南通等市部分养殖场出现不同程度的凡纳滨对虾急性死亡,发病对虾呈现为空肠空胃,肝胰胰萎缩或肿涨,表现出AHPNS发病的典型症状。从上述数十家养殖场采集不同苗种来源、不同生长阶段、不同发病特点以及不同养殖模式的健康和疑似患AHPNS的凡纳滨对虾,无菌解剖其肝胰腺,分离得到642株细菌,分别采用急性肝胰腺坏死合综合症致病性相关基因pirA~(vp)引物AP3以及细菌16S rRNA通用引物进行扩增,确认并获得28株凡纳滨对虾AHPNS致病性副溶血弧菌,根据不同的来源、模式等对所得菌株进行了分类。应用脉冲场电泳(PFGE)技术,对28株分离自江苏省内不同地区、不同养殖模式、不同生长阶段的对虾AHPNS发病个体肝胰腺的致病性副溶血弧菌进行分子分型研究,最终得到了副溶血弧菌的4个主要的PFGE簇(G 1-G4),24个谱型,带型间相似性达到86.1%-100%,表明各菌株亲源关系较近,PFGE的分型结果与样品来源的生长地点、养殖模式、发病症状、苗种来源、对虾生长阶段等具有相关性,说明在江苏省内由副溶血弧菌引起的凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合症的发生已经存在流行趋势。4个不同PFGE聚类簇的谱型存在一定的差异,这与28株菌的来源、养殖模式、发病症状以及发病对虾不同生长阶段有关。本研究初步建立了江苏省内凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症弧菌的PFGE数据资料,以便在预警防控过程中快速将不同发病样品或可疑对虾样品的副溶血性弧菌PFGE谱带与本研究结果进行比较。根据同一来源对虾个体具有共同的遗传物质,在PFGE谱带中表现出相同的指纹图谱这一原理,分析菌株间的亲缘关系,研究某疾病的传染源、流行范围等,并在此基础上进行疾病的预警预控,采取有效措施防控凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合症。从江苏南部沿海滩涂沉积物中分离得到252株细菌,以14株凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症致病性副溶血弧菌为指示菌,初筛和复筛后,获得1株拮抗效果较好的菌株H 0011;通过形态观察、生理生化特性和16S rRNA基因序列鉴定为普罗威登斯菌。利用普罗威登斯菌H 0011对凡纳滨对虾进行高密度胁迫安全性试验结果,试验期间浸浴组和投喂组对虾状态良好,没有发病和死亡现象,该菌株对凡纳滨对虾是安全的。菌株H 0011的发酵工艺结果,该菌最佳发酵生长条件为温度为30℃、盐度为10‰、pH为8、培养时间为20 h。本文首次对江苏地区不同苗种、不同地区、不同生长时期、不同养殖模式、不同死亡特点的凡纳滨对虾进行了AHPNS致病性弧菌收集及分子分型,认为江苏省内凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合症已形成流行趋势,为进一步开展江苏地区急性肝胰腺坏死综合症的分子流行病学研究提供技术资料;首次获得了对凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症具有防控作用的高效拮抗作用菌,为该病的防控提供了新的思路。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S945.46
【图文】：

序列,毒力基因,PCR检测,菌株

上海海洋大学硕士学位论文云港、盐城地区的几十份对虾样品中分离纯化至 642 株可疑致病细菌菌株。2.2.2AHPNS 病原菌的确认及鉴定通过 AP 3 扩增 642 株细菌菌株的 AP 3 序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示，编号 H289 等 28 株菌株在 333 bp 大小处有明亮条带（图 2-1），与目标条带大小一致。结果表明，这 28 株菌株为 AHPNS 的致病性细菌。

副溶血弧菌,菌株,簇中,谱系

29图 3-1 28 株副溶血弧菌 PFGE 分子分型结果Figure 3 28 Molecular Typing of Vibrio parahaemolyticus PFGE3.3.2 28 株副溶血弧菌 PFGE 簇不同地点的分布南通地区的菌株在各谱系中分布均衡，均有存在；盐城地区以 G 4 PFGE 簇w 主（5/10），同时也较均匀分布于 G 1、G 2 和 G 3 PFGE 簇中；连云港地区菌株只有 2 株，以 G 1 为主，同源性 100 %。具体见表 3-1。

系统发育树,菌株,浸浴,空肠

图 4-1 基于 16S rDNA 序列的菌株 H0011 系统发育树Figure 4-1 Phylogenetic Tree of Strain H0011 Based on 16S rDNA Sequence4.1.6.3 安全性实验通过高浓度胁迫实验测试筛选菌株 H0011 的结果如表 4-3 所示。浸浴组1×108cfu/mL、1×109cfu/mL 条件下的凡纳滨对虾，在整个实验过程中健康，且摄食正常又活力良好，无空肠和死亡现象；浸浴组 1×1010cfu/mL 的三个平行组中有一组对虾出现 1 尾空肠现象。投喂组对虾在整个实验过程中健康，且摄食正常又活力良好，无空肠和死亡现象。试验期间，浸浴组空白对照组对虾无死亡，但其中有一组出现 1 尾空肠现象。因此 108cfu/mL 浓度以下的浸浴组和投喂组与生理盐水组无显著性差异（P㧐0.05）。

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