鱼类烂鳃病病原柱状黄杆菌基因工程疫苗的研究

发布时间：2020-08-11 19:28

【摘要】：柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种革兰氏阴性细菌,是引起鱼类柱形病(Columnaris disease)的病原。该菌能感染多种淡水性鱼类,给水产养殖业造成重大的经济损失。目前,主要依靠使用化学药物对柱形病进行预防和治疗,然而药物的大量使用会导致水产品药物残留的食品安全问题,以及对水生态系统的影响和耐药菌株的出现等问题。开展柱状黄杆菌基因工程疫苗的研究将为柱形病的防治提供新思路和更为有效的方法。细菌的外膜蛋白是细菌与宿主相互作用的界面,容易被宿主识别而引起机体的免疫反应,因此被认为是制备抗原的良好材料。利用双向电泳(2-DE)并结合免疫印迹的方法,在柱状黄杆菌外膜蛋白中筛选到5个免疫原性蛋白,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)鉴定,它们是:gliding motility lipoprotein Gld J(Gld J)、hypothetical protein FCOL_09735(fcol)、F0F1 ATP synthase subunit beta(f0f1)、lipoprotein(lip)和outer membrane efflux protein precursor(omepp)。将这5个免疫原性蛋白基因进行PCR扩增后,与原核表达载体p ET28a连接,分别构建了原核表达质粒p ET28a-gld J、p ET28a-fcol、p ET28a-lip、p ET28a-f0f1和p ET28a-omepp。然后,将这些质粒分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞,并通过IPTG诱导表达相应的蛋白。将纯化后的蛋白免疫草鱼,草鱼体内产生了特异性的抗体,而且一些免疫相关基因的表达也有上调,这些基因包括Interleukin 1β(IL-1β)、IL-8和IL-10,IFN-I和IFN-γ、Immunoglobulin M(Ig M)、Ig D、Ig Z、Major histocompatibility complex I(MHC Iα)和MHC IIβ、C-reactive protein(CRP)。这5个重组蛋白,rgld J、rfcol、rf0f1、rlip和romepp对用柱状黄杆菌攻毒后草鱼的免疫保护率依次为72%、8%、32%、64%和68%。且rgld J、rlip和romepp蛋白免疫组的草鱼血清对柱状黄杆菌的生长有显著的抑制作用。这些实验结果表明这3个基因是柱状黄杆菌的保护性抗原基因,可以作为制备柱状黄杆菌基因工程疫苗的候选抗原。另一方面,毒力因子被认为是很好的疫苗候选基因。为了提高免疫原性和增强保护效果,将柱状黄杆菌的5个可能的毒力因子基因,锌蛋白酶、脯氨酸寡肽酶、嗜热蛋白酶、胶原酶和硫酸软骨素AC裂解酶的抗原片段进行融合,构建了它们的融合复合体的原核表达质粒p ET32a-zptcc,并表达了相应的融合蛋白。将纯化后的融合蛋白免疫草鱼,发现草鱼血清中出现了特异性抗体,且免疫后草鱼血清中IL-1β、IL-8、IL-10、Ig M、IFN-I、CRP和MHC Iα等基因出现显著上调,而且该融合蛋白对用柱状黄杆菌攻毒后草鱼的免疫保护率为39%,说明该融合蛋白有一定的免疫保护效果。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941.4
【图文】：

单克隆抗体,草鱼,黄杆菌,外膜蛋白

rIgD 和 rIgZ 蛋白能与相应的单克隆抗体反应（图2-1），说明鼠抗草鱼 rIgM，rIgD 和 rIgZ 蛋白单克隆抗体是有效的。2.3.2 柱状黄杆菌外膜蛋白双向凝胶电泳图谱用 PDquest 软件对柱状黄杆菌外膜蛋白的双向电泳图片分析结果表明，共有 196个蛋白被成功分离（图 2-2A）。蛋白点主要集中在酸性端。根据预染蛋白质 Marker，可以判断分离的蛋白质点的分子量基本处于 25 kDa-130 kDa 之间。2.3.3 柱状黄杆菌外膜蛋白中免疫原性蛋白的筛选和鉴定利用免疫印迹的方法，在柱状黄杆菌外膜蛋白双向电泳凝胶中筛选到 7 个免疫原性蛋白点，经鉴定为 5 种不同的蛋白（表 2-3）。分别为 gliding motility lipoproteinGldJ（GldJ），hypothetical protein FCOL_09735（fcol）

黄杆菌,外膜蛋白,双向电泳,柱状

图 2-2 柱状黄杆菌外膜蛋白双向电泳图谱和相应的 Western-blot 分析Figure 2-2 Out member proteins (OMPs) of Flavobacterium columnare G4separated on2-dimensional electrophoresis (2-DE) gels and recognized by grass carp antibacterial sera andanti-grass carp-Ig monoclonal antibodies.（A）柱状黄杆菌外膜蛋白双向电泳图谱；（B）被草鱼 IgM 所识别的免疫原性蛋白；（C）被草鱼 IgD 所识别

示意图,示意图

图 3-1 重组原核表达质粒 pET28a-gldJ, pET28a-fcol, pET28a-lip, pET28a-f0f1 和 pET28a-omepp 的构建示意图Figure 3-1 Schematic representation of therecombinant porkaryotic expression plasmid pET28a-gldJ,pET28a-fcol, pET28a-lip, pET28a-f0f1 and pET28a-omepp

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