柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼免疫活性的研究

发布时间：2020-08-13 01:51

【摘要】：草鱼(Ctenopharyngodon idellus)作为我国最大的淡水鱼类养殖品种,在湖北省以至全国都有很大的养殖规模,随着养殖密度和养殖规模的增加,疾病暴发在所难免。其中由柱状黄杆菌(Flavobacterium cloumnare)引起的草鱼烂鳃病是危害草鱼养殖产业的重要疾病,每年都会给草鱼的养殖业造成很大的经济损失。过去几年,使用抗菌药物防治柱形病已经导致多重耐药菌株的出现。免疫增强剂具有副作用小、可引起特定的细胞反应和预防某些特定的病原体等优点,在水产养殖中已有部分应用。相关研究表明,细菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)可以增强鱼类抵抗病原感染的能力,提高其免疫应答水平,是亟待开发的新型多糖类免疫增强剂。目前开发较多的是海洋和极地微生物的胞外多糖,水产动物致病菌的胞外多糖因其特殊的免疫原性,有望成为新型的免疫增强剂。因此,本研究以草鱼为研究对象,探究柱状黄杆菌的EPS作为免疫增强剂对草鱼免疫功能的影响。主要的研究结果如下:1.柱状黄杆菌EPS的制备。用本实验室前期从黄颡鱼病鱼上分离的一株柱状黄杆菌Pf1,发酵培养得到含大量胞外多糖的上清液,经三氯乙酸除蛋白、乙醇反复沉淀、蒸馏水透析、PEG20000浓缩后得到纯度较高的EPS。用苯酚硫酸法测得EPS的浓度为1.2 mg/m L。2.EPS对草鱼血清酶及免疫保护率的影响研究。采用酶标仪检测草鱼血清中酶的活力,注射EPS的草鱼与对照组相比,用柱状黄杆菌浸泡感染前,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性显著降低,细菌感染后,AKP酶活性显著升高,并在第4天时,酶活性最大;实验组在感染的第2 d,超氧化物歧化酶(Super oxide Dismutase,SOD)活性显著高于对照组,达到最大;草鱼注射0.2 mg EPS一周后,与对照组相比,在浸泡感染柱状黄杆菌的第14 d,注射EPS的草鱼存活率为85%,远高于对照组的55%,草鱼的免疫保护率为67%。该结果表明,柱状黄杆菌产生的EPS可作为免疫增强剂使用。3.EPS对草鱼免疫相关基因影响的研究。实时荧光定量PCR检测结果表明,草鱼注射0.2 mg EPS一周后,与对照组相比,在浸泡感染柱状黄杆菌的第4 d,在肝脏、脾脏、头肾中,注射组的白介素1(IL-1)、组织相容性复合体I(MHC I)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的m RNA表达水平显著提高;短链五聚素(PTX)在草鱼的肝脏中,表达无显著差异;在感染第4 d,PTX在脾和头肾中的表达量显著提高;四个基因在体肾的表达变化呈现不同的规律。该结果表明,柱状黄杆菌产生的EPS可以加强机体的炎症反应、体液免疫和抗原提呈能力。结果表明:柱状黄杆菌的EPS能够增强草鱼对柱状黄杆菌的抵抗力,提高草鱼的免疫应答水平。EPS注射后的草鱼,在柱状黄杆菌感染时可产生和分泌更多的AKP、SOD。EPS可以使IL-1、MHC I、PTX和TNF-α等免疫相关基因表达量升高,增强草鱼的免疫功能,显著提高草鱼的存活率。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943
【图文】：

曲线,胞外多糖,含量标准,黄杆菌

柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼免疫活性的研究验结果苯酚硫酸法测定柱状黄杆菌胞外多糖浓度照 2.2.3 的操作，以葡萄糖质量浓度为横坐标，OD 值为纵坐标绘制成标准曲线，结果如图 2.1 所示，得到回归方程 y=0.0077x+0.0405，相0.9972。此图表明，多糖质量浓度在 0.02-0.2 mg/mL 范围内与 OD490性关系。用此方法测得提取的 EPS 的浓度为 1.2 mg/mL。

黄杆菌,柱状,草鱼,血清AKP活性

柱状黄杆菌 EPS 对感染柱状黄杆菌的草鱼血清 AKP 活*P < 0.05,**P < 0.01The effects of EPS from F.columnare onAKP activity of graschallenge of F.columnare, *P < 0.05,**P < 0.01.糖对柱状黄杆菌攻毒的草鱼血清 SOD 的影响杆菌浸泡感染前，注射 EPS 组的草鱼（EF 组）血液中的组（CF 组）的草鱼没有显著差异；用柱状黄杆菌浸泡感染的 SOD 活性没有显著影响；在感染柱状黄杆菌的 2 d 时 CF 组（图 4.2）。

黄杆菌,柱状,草鱼

柱状黄杆菌 EPS 对感染柱状黄杆菌的草鱼血清 AKP 活*P < 0.05,**P < 0.01he effects of EPS from F.columnare onAKP activity of graschallenge of F.columnare, *P < 0.05,**P < 0.01.糖对柱状黄杆菌攻毒的草鱼血清 SOD 的影响杆菌浸泡感染前，注射 EPS 组的草鱼（EF 组）血液中（CF 组）的草鱼没有显著差异；用柱状黄杆菌浸泡感染的 SOD 活性没有显著影响；在感染柱状黄杆菌的 2 d 时 CF 组（图 4.2）。

【参考文献】