草鱼转录因子Runx1和Runx3的分离鉴定及其免疫功能研究

发布时间：2020-08-13 12:14

【摘要】：Runt相关转录因子(Runt-related transcription factor,Runx)是一个转录因子家族。哺乳动物Runx家族包含3个成员:Runxl、Runx2和Runx3,它们在多种生理活动中发挥了重要调节作用。其中Runx1和Runx3在免疫系统中的功能更令人关注,主要参与调节免疫细胞的增殖、分化和功能等。目前,虽然斑马鱼和河渶的Runx家族成员及其辅助因子CBFβ已被克隆和鉴定,但是Runx1和Runx3在鱼类的免疫学功能还未知。本论文以草鱼为研究模型,首先鉴定了Runx1、Runx3及CBFβ的分子特征,然后提供它们参与免疫反应的证据,最后阐明它们的免疫调节功能,特别是在介导转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)调节作用中的地位。研究内容如下:1.草鱼Runx1和Runx3的分离鉴定和诱导表达分析:(1)通过简并PCR和RACE PCR等多次PCR反应,克隆获得草鱼Runx1五种剪接体(Runx1 v1-5)和Runx3的cDNA序列。结构特征分析、氨基酸多序列比对及系统进化树分析证明它们分别是哺乳动物的Runx1和Runx3的同源基因。(2)Runx1的五种剪接体中,Runx1 v1-3具有完整的功能结构域,包括转录活化结构域(transactivation domain,TAD)、抑制结构域(inhibitory domain,ID)、PY模体及C末端VWRPY模体,而Runx1 v4-5缺乏TAD、ID、PY及VWRPY等功能结构域。组织分布检测发现Runx1v1-3和Runx1 v4-5具有相似的组织分布特征,在胸腺中表达水平最高,其次是脾、肾、头肾等组织,在外周血白细胞中表达较高;Runx3在胸腺和脾中表达水平最高,其次是外周血白细胞。(3)LPS和PHA均能刺激草鱼外周血白细胞Runx1 v1-3、Runx1 v4-5和Runx3基因表达上调,而poly I:C只对Runx1 v1-3和Runx3有诱导作用。(4)嗜水气单胞杆菌感染促使草鱼Runx1 v1-3和Runx3在头肾、脾及胸腺组织中的表达不同程度增强,而Runx1 v4-5的表达上调仅发生在脾和胸腺组织。Runx1 v1-3和Runx1 v4-5在体内外免疫刺激实验中呈现出不同的时间动力学特征,说明它们的免疫功能可能存在差异;推测Runx1 v4-5可能作为一种天然存在的抑制剂,调控硬骨鱼Runx1信号通路中过度的激活反应。2.草鱼Runx辅助因子CBFβ的分离鉴定和表达特征:(1)通过多种PCR技术,分离获得草鱼CBFβ的cDNA序列;氨基酸多序列比对及系统进化树分析证明它是哺乳动物CBFβ的同源基因。(2)3D同源建模表明草鱼CBFβ的空间结构与哺乳动物CBFβ的空间结构相似度极高;CBFβ在结构上的高度保守性暗示了其在进化过程中的功能保守性。(3)CBFβ和Runx1、Runx3具有相似的组织分布特征,在胸腺中表达水平最高,其次是脾、头肾,在外周血白细胞中表达较高。(4)cbfβ主要定位于细胞核,证明了其作为转录因子发挥功能的基本特性。(5)lps、pha和polyi:c均能刺激草鱼外周血白细胞cbfβ基因表达上调。(6)嗜水气单胞杆菌感染草鱼后,cbfβ基因在头肾、脾和胸腺组织中表达水平上调,进一步确证cbfβ参与了硬骨鱼免疫反应。3.草鱼runx1和runx3的功能鉴定:(1)runx1五种剪接体和runx3无需刺激,即能够直接入核,证明它们作为转录因子发挥功能的基本特性。(2)进一步探讨草鱼runx1和runx3对t细胞亚型的标志细胞因子和转录因子表达的影响。采用runx1抑制剂的研究发现:草鱼外周血白细胞中lps、pha和polyi:c诱导草鱼细胞因子ifn-?、il-17a/f1和il-17a/f2基因的表达,这些刺激作用被阻断runx1信号所抑制。但阻断runx1信号并不影响polyi:c对转录因子foxp3表达的上调。(3)由于没有特异的runx3抑制剂,采用过表达草鱼runx3方法的结果显示:在草鱼肾细胞系(grasscarpkindneycelllines,cik)中,过表达草鱼runx3上调转录因子t-bet的表达,而抑制转录因子gata3的表达,但过表达runx3或/和cbfβ对foxp3的基因表达水平无影响。(4)研究草鱼runx1、runx3和辅助因子cbfβ的相互作用关系,结果显示:草鱼runx1和runx3之间并无相互作用关系,但过表达runx1的两种代表性剪接体和runx3均显著诱导cbfβ基因的表达,提示cbfβ可能参与runx1和runx3的调节作用。但是过表达的cbfβ并没有协同runx3的作用,可能因为内源性的cbfβ足以满足runx3发挥功能,或者runx3-cbfβ的协同作用还需要其它转录因子的参与。4.草鱼tgf-β免疫调节作用中runx1和runx3的表达和功能研究:(1)在草鱼外周血白细胞中,重组的草鱼tgf-β1上调草鱼cbfβ基因的表达,而对runx1v1-3和runx1v4-5基因的表达存在先上调再下调的双重调节作用,提示它们在tgf-β的免疫调节作用中不同的诱导表达特征。(2)特别地,与诱导cbfβ和runx1表达比较,tgf-β1更显著提高runx3的mrna水平。为强化该结果,本研究还检测了草鱼tgf-β1对runx3蛋白表达的影响,为此首先制备和鉴定草鱼runx3多克隆抗体。wb分析显示runx3多克隆抗体能识别分子量约为49kda的runx3重组蛋白和外周血白细胞中的内源性runx3蛋白(分子量约为46kda),证明了该抗体的有效性。采用该抗体的wb的结果显示tgf-β1刺激runx3的蛋白高表达,说明runx3可能是runx家族中tgf-β1作用的主要成员。(3)为检验runx1和runx3参与tgf-β调节作用的假设,在外周血白细胞中研究在tgf-β1抑制c-myc表达过程中runx1和runx3的功能。具体地,抑制runx1信号放大了tgf-β1对c-myc的抑制作用,提示runx1可能是tgf-β1调节c-myc表达的负调控因素。相反地,过表达Runx3反而放大TGF-β1对c-Myc表达的抑制作用,提示Runx3可能促进了TGF-β1的该调节作用。为明确Runx3的上述功能,进一步构建Runx3显性失活质粒,在CIK中过表达该质粒后c-Myc的表达明显上调,但TGF-β1能够抑制该刺激作用。结合上述(2)的结果,即TGF-β1明显刺激Runx3的产生,这些结果提示TGF-β1可能通过诱导Runx3的产生来抑制c-Myc的表达。但Runx1和Runx3在TGF-β1调节c-Myc表达中发挥不同功能的机制有待研究。(4)进一步,在外周血白细胞中研究在TGF-β1调节炎症相关新分子nIL-1F表达过程中Runx1和Runx3的功能。结果显示TGF-β1抑制nIL-1F的表达,但Runx1和Runx3均没有参与TGF-β1的该抑制作用,提示Runx1和Runx3并没有参与TGF-β1的所有调节活动。总之,本论文在阐明草鱼Runx1、Runx3及CBFβ的分子特征基础上,提供它们参与了鱼类免疫反应的证据,首次诠释了鱼类Runx1和Runx3的免疫调节功能,特别揭示了它们在TGF-β1免疫调节作用中的地位,从而增加了基于转录因子调控的鱼类免疫学知识。
【学位授予单位】：电子科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：

图 1-1 转录因子网络调节 T 细胞的谱系选择[4]2 转录因子网络调节外周初始 CD4+T 细胞分化成 Th 细胞和 Treg 细胞在调控T细胞的发育和分化的转录因子网络中处于枢纽地位参与调控B细胞的发育和分化，且与B细胞的功能密切相关[43]。

3 1-2 转录因子网络调节外周初始 CD4+T 细胞分化成 Th 细胞和 Treg 细胞亚群了在调控T细胞的发育和分化的转录因子网络中处于枢纽地位，R 还参与调控B细胞的发育和分化，且与B细胞的功能密切相关[43]。RunB细胞发育的各个阶段[44-46]，采用诱导灭活的方法使Runxl或CBFβ不小鼠遭遇B细胞发育障碍且分化停滞[47, 48]，而敲除定向造血干细则导致前B细胞和成熟B细胞数量的减少[49]。Runx3 也在B细胞系中在免疫球蛋白的类别转换成IgA过程中发挥了重要作用[51]。此外，R树突状细胞中特异地表达，敲除Runx3 的小鼠的树突状细胞激活CD且β2-整合素表达异常[51]。

及氨基酸序列的分析通过简并PCR和RACE PCR等多次PCR, 克隆获得草鱼Runx1 五种剪接体cDNA (GenBank ID: KF411035 KF411039) 。其中Runx1 v1 的cDNA序列最长(图3-1)，包含 222 bp的 5′UTR，1383 bp的CDS和 213 bp的 3′UTR。图 3-1 草鱼 Runx1 v1 的 cDNA 及氨基酸序列注：cDNA 序列用小写字母表示；氨基酸序列用大写字母表示；图右数字代表该行末位核苷酸位点，起始密码子和终止密码子加方框显示；多聚腺苷酸信号用斜体加下划线表示。

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本文编号：2791983