斑节对虾Akirin基因的分子克隆及免疫功能研究

发布时间：2020-08-14 20:05

【摘要】：斑节对虾(Penaeus monodon)是我国重要的水产养殖经济物种。近年来,养殖环境污染引起的对虾病原菌感染病害问题日益严重,制约了斑节对虾养殖产业的健康发展。弧菌是一类普遍分布于海湾的河口和沿海水域中的革兰氏阴性病原菌,其中副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)能引起对虾“红腿病”和“烂鳃病”等病症,还是导致“急性肝胰腺坏死综合症”,又称“早期死亡综合症”(early mortality syndrome,EMS)暴发,造成对虾大量死亡的主要原因。对虾的先天性免疫是维持虾健康的重要屏障,因此,深入的研究斑节对虾的先天性免疫防御,对于控制对虾疾病,健康发展对虾养殖具有重要的意义。抗菌肽(Antimicrobialpeptides,AMP)是指生物体内产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质,存在于所有真核生物中是先天免疫系统中,是先天免疫系统的重要组成部分。甲壳类动物中发现的抗菌肽主要包括抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)、甲壳肽(Crustin)和对虾素(Penaeidin)等。Akirin是一类由180~204个氨基酸酸残基组成的高度保守的核蛋白,在先天性免疫调控中发挥重要的作用。Akirin广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中。研究发现该基因在果蝇天然免疫通路中具有重要的作用。当其被沉默表达之后,果蝇抗菌肽Attacin的表达量降低了90%。与此同时,果蝇明显容易受到革兰氏阴性细菌感染。本研究成功克隆了斑节对虾Akirin基因(命名为PmAkirin),并初步探究了它的免疫功能。PmAkirin cDNA序列全长1508bp,其中包括编码213个氨基酸的ORF 642bp、一个50bp的5’-UTR和一个816bp的3’-UTR。通过ExPASy软件预测PmAkirin的蛋白分子量为23.82 KDa,理论等电点为9.05。根据已有的文献分析,PmAkirin包含两个核定位信号,分别是26~30位(KRRRC)和78~81位(KRRK)。这和多数哺乳动物的Akirin2序列相一致。另外PmAkirin还包含一个抗菌结构域,DEFSN结构域(3~34位)。通过多重序列比对分析,表明Akirin具有较高的保守性,其中N端和C端的保守性相对较强,进化上我们通过对不同物种的Akirin蛋白序列分析发现,Akirin被分为脊椎动物和无脊椎动物两大类,其中脊椎动物又分为Akirin1和Akirin2两小类。PmAkirin是其中无脊椎动物一类的,与凡纳滨对虾(南美白对虾)和日本囊对虾的进化关系最近,与脊椎动物的Akirin2进化关系较近。通过qRT-PCR检测发现,PmAkirin在鳃、肝胰腺、胃、心脏、肠、肌肉和血淋巴等七个组织中均有表达。其中PmAkirin在血淋巴中表达量最高,其次是在心脏、鳃、胃和肝胰腺,在肠和肌肉中表达量较低。为了探究PmAkirin对抗菌肽表达调控及其在斑节对虾先天性免疫中的重要作用,我们对其进行了dsRNA-Akirin和mRNA-Akirin的干扰实验和过表达实验。通过原位杂交实验和qRT-PCR检测发现,dsRNA-Akirin和mRNA-Akirin的干扰和过表达实验,成功的特异性干扰和过表达了PmAkirin。在副溶血性弧菌感染斑节对虾之后,肝胰腺组织中的PmAkirin mRNA表达水平显著性上调。与感染前相比,感染后12h时,mRNA-Akirin、dsRNA-Akirin、dsRNA-GFP、PBS和空白对照五组分别为感染前的1.67、1.74、1.75、1.5和1.74倍。说明PmAkirin在免疫调控中发挥重要作用。通过dsRNA-Akirin的干扰实验,特异性干扰PmAkirin mRNA 24h后,再注射副溶血性弧菌,与菌感染组相比,抗脂多糖因子(ALF)PmALF2、PmALF3和PmALF6等抗菌肽基因mRNA的表达水平分别为0.5、0.39和0.42倍,甲壳肽(Crustin)PmCrus1和PmCrus4等抗菌肽基因mRNA的表达水平分别为0.39和0.35倍,对虾抗菌素(Penaeidin)PmPEN3a、PmPEN3b和PmPEN5等抗菌肽基因mRNA表达水平分别为0.44、0.45和0.46倍。通过mRNA-Akirin的过表达实验,特异性过表达PmAkirin mRNA 24h后,再注射副溶血性弧菌,与菌感染组相比,抗脂多糖因子(ALF)PmALF2、PmALF3和PmALF6等抗菌肽基因mRNA的表达水平分别为1.7、1.74和2.61倍,甲壳肽(Crustin)PmCrus1和PmCrus4等抗菌肽基因mRNA的表达水平分别为1.97和1.58倍,对虾抗菌素(Penaeidin)PmPEN3a、PmPEN3b和PmPEN5等抗菌肽基因mRNA表达水平分别为1.86、1.79和2.07倍。这表明PmAkirin可能参与了抗菌肽基因的表达调控。通过dsRNA-Akirin和mRNA-Akirin的干扰和过表达实验,特异性干扰和过表达PmAkirin mRNA后,再通过肌肉注射副溶血性弧菌感染斑节对虾,发现(dsRNA-Akirin+菌)组,虾的血淋巴中副溶血性弧菌的浓度显著高于菌感染组、(dsRNA-GFP+菌)组和(PBS+菌)组,大约是菌感染组的1.87倍,而存活个数远则低于菌感染组、(dsRNA-GFP+菌)组和(PBS+菌)组;(mRNA-Akirin+菌)组,虾的血淋巴中副溶血性弧菌的浓度显著低于菌感染组、(dsRNA-GFP+菌)组和(PBS+菌)组,大约是菌感染组的0.41倍,存活个数远高于菌感染组、(dsRNA-GFP+菌)组和(PBS+菌)组,我们推测PmAkirin通过对抗菌肽的表达调控,参与了对斑节对虾血淋巴中副溶血性弧菌的清除过程,从而影响了病原菌感染后对虾的存活率。本文对斑节对虾的Akirin基因进行了免疫功能研究。证明了PmAkirin可以对下游抗菌肽的表达进行调控。PmAkirin具有的一个DEFSN抗菌结构域。这些结果表明PmAkirin在斑节对虾的先天性免疫中具有重要的作用。这为深入研究对虾的先天性免疫机理以及促进对虾健康养殖工作提供了理论依据。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

斑节对虾

第一章引言1.1 斑节对虾简介斑节对虾(Penaeus monodon)，又被称为黑虎虾(Black tiger shrimp)和草虾shrimp)(图 1-1)，隶属于节肢动物门(Arthropoda) 、甲壳纲(Crustacea)、十(Decapoda)、对虾科(Penaeidae)、对虾属(Penaeus)。斑节对虾的个体大，产量生长迅速、肉质鲜美和食性广泛，是当前世界三大养殖虾类之一[1]。斑节对虾属中体型最大的种，发现的最大体长为 33cm，体重超 500g。成熟的斑节常体长能够达到 22.5～32 厘米，体重 137～211 克。斑节对虾广泛分布于印及太平洋区域[2]。这些年，在墨西哥湾的北部以及美国南部的大西洋区域也分布[2]。自上个世纪的 80 年代开始，斑节对虾的养殖规模日益增大。在我节对虾的养殖多分布在南方沿海地区，是一种重要水产养殖经济种类之一[3]

菌膜,革兰氏阴性菌

图 1-2.革兰氏阴性菌菌膜[58]Fig. 1-2 Gram-negative bacteria cell membrane[58]甲壳肽通过两性分子的模式插入病原菌细胞膜，进而破坏细胞膜结构，达到抗菌的目的；抗脂多糖因子是可以与脂多糖结合的多肽分子，通过结合细菌的类脂 A，从而破坏病原菌细胞壁上内毒素的毒性，起到抗菌作用；对虾抗菌素是一种阳离子抗菌肽，通过破坏细菌细胞膜，使其细胞质外流，细菌裂解死亡，产生抗真菌和细菌效应[59]。Destoumieux 等在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的血细胞和血浆中提取出了几种抗菌肽,并检测了 3 种抗菌肽的氨基酸序列,初次发表了甲壳动物的抗菌肽氨基酸的完整序列[60]。在 2004 年 Cuthbertson 等人，在凡纳滨对虾的血细胞 cDNA 文库中发现了一种新的对虾抗菌素，序列不同于以往发现的对虾抗菌素，可以有效杀死尖孢镰刀菌[61]。2011 年高焕等人[62]发现，在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) 感染了对虾白斑综合病毒(WSSV)后，它的肝胰腺、鳃、肌肉和肠等组织出现了抗菌肽的显著变化。Shanthi 等人从印度白对虾

示意图,果蝇,示意图,对虾

上海海洋大学硕士学位论文纳滨对虾的先天免疫中存在作用[66]。而 Akirin 通过革兰氏阴性菌感染后其表达平显著上升，而通过革兰氏阳性菌感染后 Akirin 表达水平无显著改变[83]。在日囊对虾中，也呈现这种情况，当虾受到鳗弧菌(V. anguillarum)感染后，Akirin 表水平显著性上调，而用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染后，和对照组比 Akirin 表达水平无显著性变化，说明 Akirin 只对革兰氏阴性菌具有作用，而革兰氏阳性菌没有免疫防御[28]。

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