miRNA在长牡蛎环境胁迫应答中的调控作用
发布时间：2020-08-15 17:17
【摘要】：潮间带区域环境复杂多变,长牡蛎作为典型潮间带生物,终生营固着方式生存于潮间带区域,进化形成了较强的抗病原侵染、抗干露胁迫等抗环境胁迫机制。miRNA作为重要的表观调控手段,能够在转录后水平调控基因表达,参与免疫应答等生理过程。然而目前对miRNA的研究主要集中于高等动物或其他模式生物中,在无脊椎非模式生物中的研究还处于起步阶段。本研究以长牡蛎为材料,通过分子生物学、细胞生物学与生物信息学的手段,鉴定了长牡蛎血淋巴细胞miRNA,并概述了其在神经内分泌免疫调节系统中的作用;基于长牡蛎免疫过程,筛查了关键代表性miRNA,并解析了其在病原胁迫下介导的免疫应答调控机制;通过多组学整合分析,筛选了干露胁迫相关mi RNA,探究了其介导的干露适应调节机制。通过二代测序技术结合生物信息学分析,对长牡蛎mi RNA进行了全基因组范围的筛查及鉴定,在长牡蛎中发现了331条miRNA,其中76条为保守miRNA,255条为全新miRNA,长牡蛎中鉴定出的miRNA数量为已知贝类中最多。有38条长牡蛎miRNA同时被发现响应免疫调质乙酰胆碱ACh或去甲肾上腺素NE刺激,并能够靶定355个长牡蛎基因,其中包括免疫识别受体,免疫通路信号分子,免疫效应分子及神经内分泌相关分子等。从长牡蛎中鉴定出保守miRNA cgi-miR-92d,其表达水平在免疫应答早期显著下调,在免疫应答后期迅速升高。CgLITAF3作为长牡蛎LITAF同源基因及cgi-miR-92d的靶基因,其表达水平在免疫应答早期迅速上升,在免疫应答后期显著下降。体外双荧光实验结果表明,cgi-miR-92d能够通过结合CgLITAF3编码区抑制其表达。体外过表达实验表明,CgLITAF3能诱导HEK293T细胞中HsTNF-α表达,且诱导效果受cgi-miR-92d抑制。CgTNF作为长牡蛎TNF-α同源基因,其表达水平在免疫应答早期显著升高,而在免疫应答后期显著下降,且趋势晚于CgLITAF3。研究发现,病原刺激后,敲减长牡蛎体内cgi-miR-92d能够显著降低CgLITAF3及CgTNF表达水平。scaffold42648_5080是长牡蛎特有miRNA,编码于长牡蛎基因内含子区域。scaffold42648_5080能响应LPS刺激且在免疫应答早期显著下调。同时能够靶定包括CgILK在内的31个长牡蛎基因,参与细胞通讯、定位、应激反应等调控过程。其中,CgILK作为长牡蛎integrin通路中核心信号转导分子,同样能响应LPS刺激且显著上调。通过双荧光素酶报告基因实验证实,scaffold42648_5080能够在体外结合CgILK 3’-UTR,并抑制其表达。在免疫应答过程中,长牡蛎血细胞迁移能力随CgILK表达量的升高或降低而发生相应变化,在体内敲减scaffold42648_5080后,CgILK表达水平显著升高,长牡蛎血淋巴细胞迁移能力显著升高。免疫细胞吞噬作用是机体清除外来病原的重要机制,受NF-κB等通路调控。灿烂弧菌刺激后长牡蛎血淋巴细胞吞噬能力显著升高而NF-κB通路中核心抑制因子CgIκB2表达水平显著降低。体内敲减CgIκB2基因后,长牡蛎血淋巴细胞吞噬能力显著升高。长牡蛎能够编码一个无脊椎动物特有的mi RNA cgi-miR-2d。灿烂弧菌刺激后,其表达水平迅速升高,趋势与CgIκB2基因相反。生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验显示,cgi-miR-2d能够结合CgIκB2 3’-UTR并抑制其表达。同时,在长牡蛎体内过表达cgi-miR-2d后,CgIκB2基因表达水平显著降低,细胞吞噬能力显著升高;在长牡蛎体内敲减cgi-miR-2d后,CgIκB2基因表达水平略有升高,细胞吞噬能力迅速降低。乙酰胆碱ACh是胆碱能神经系统主要的神经递质,也是重要的免疫调质。贝类具有原始的胆碱能神经免疫调节系统,并能参与调控其免疫反应。研究发现,灿烂弧菌刺激12小时后,长牡蛎血淋巴细胞中ACh显著升高,同时长牡蛎胆碱转运体同源基因CgCTL1表达量在免疫应答前期降低,在免疫应答后期恢复正常。敲减CgCTL1后,长牡蛎血淋巴细胞内胆碱及细胞外ACh含量显著降低,CgTNFs表达水平显著升高。生物信息学分析及双荧光实验表明,cgi-miR-2d能够结合CgCTL1 3’-UTR并抑制其表达。体内过表达cgi-mi R-2d后CgCTL1表达水平显著降低,血淋巴细胞内胆碱转运与ACh合成释放迅速下降,CgTNFs表达水平升高;体内敲减cgi-mi R-2d后,CgCTL1表达水平显著升高,血淋巴细胞内胆碱含量显著增加,细胞外ACh含量及CgTNFs表达水平保持不变,细胞抗菌能力显著降低。去甲肾上腺素NE是高等动物儿茶酚胺能系统中主要的神经递质,也是重要的应激激素。长牡蛎具有原始的儿茶酚胺能系统,并在干露胁迫后迅速激活。干露胁迫后cgi-miR-365表达水平显著升高,且在NE受体封闭后降低表达。靶基因分析表明,cgi-miR-365能够靶定CgHSP90AA1在内15个长牡蛎基因,参与调控物质代谢及胁迫应激等生理过程。其中,CgHSP90AA1能响应NE刺激并在干露胁迫后表达升高。双荧光实验表明,cgi-mi R-365能够结合CgHSP90AA13’-UTR并促进其表达。在长牡蛎原代细胞中过表达cgi-miR-365后,CgHSP90AA1表达水平显著升高。在干露胁迫的长牡蛎中敲减cgi-miR-365后,CgHSP90AA1表达水平则显著降低。长牡蛎钙调蛋白CgCaM是细胞内重要的钙离子结合蛋白,能够激活一氧化氮合酶NOS,促进NO合成释放。NO是细胞内重要的炎症调控因子,参与调节细胞因子表达。干露胁迫后,长牡蛎血淋巴中CgCaM与细胞因子CgTNF等表达水平、NOS活性、NO含量呈现相似的先降低后升高的趋势,而钙离子浓度持续升高。对CgCa M进行抑制剂注射或体内敲减后,发现NOS酶活、NO含量、CgTNF等细胞因子表达水平均显著降低。研究发现scaffold631_909、cgi-miR-7、scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c、cgi-mi R-92e、cgi-miR-92f、scaffold1600_212等8个长牡蛎mi RNA能够调控CgCaM。与此同时,scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c及scaffold1600_212等6个miRNA在干露后迅速上调表达,后期表达回落。双荧光实验表明,以上miRNA能够在体外结合CgCaM 3’-UTR并抑制其表达。同时,干露胁迫后,在长牡蛎体内过表达单一miRNA,CgCaM表达水平显著降低,NOS酶活、NO含量、CgTNF表达水平显著降低;而敲减单一miRNA,CgCaM表达水平、NOS酶活、NO含量、CgTNF表达水平则无显著变化。干露胁迫中同时敲减scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c及scaffold1600_212,CgCaM表达水平、NOS酶活、NO含量、CgTNF表达水平则显著升高。干露胁迫中持续注射CgCaM或NOS的抑制剂CDZ或L-NMMA后,长牡蛎肝胰腺损伤情况显著好转。本研究的结果表明,长牡蛎具有复杂的mi RNA介导的环境胁迫应答调控机制,能够通过靶定免疫识别受体,免疫通路信号分子,免疫效应分子及神经内分泌相关分子等系统地调控机体免疫应答反应及干露胁迫应答反应,miRNA调控机制对于长牡蛎适应潮间带环境具有重要生理意义。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：
2图 1.1 动物 miRNA 转录及调控机制模型(He and Hannon, 2004)Fig 1.1 the Biogenesis and Function of Animal miRNA实际研究中对 miRNA 的界定通常还需要参考以下几个标准 (Kim, 2005)。首先是 miRNA 的表达水平， 般情况下 miRNA 的存在需要经过 Northern blot 验证，或者经过 RT-PCR、miRNA 芯片，二代测序等证实。尤其是 Northern blot实验被认为是验证 miRNA 成熟体或前体序列的经典方法；随着大规模测序技术成本的降低，基于高通量测序技术的方法逐渐成为鉴定 miRNA 的主流方案。其
miRNA 在长牡蛎环境胁迫应答中的调控作用的突出 (Gwizdek et al., 2003; Zeng and Cullen, 2004)。转运至细胞iRNA 将会在 RNA 酶 III Dicer 的催化下进 步剪切，脱去环状结构，NA 双链复合体（miRNA duplexes） (Hutvágner et al., 2001; Knight and)。miRNA 双链复合体极不稳定，在果蝇中能够受到 Dicer-R2D2 催化链选择（strand selection）形成成熟的 miRNA 序列 (Liu et al., 2003)。NA 成熟过程中重要的 RNA 酶，Dicer 广泛存在于几乎所有真核生物中同物种中可能具有多个同源基因，并行使不同的功能 (de Jong et al., herjee et al., 2013)。如，果蝇中存在 Dicer-1 与 Dicer-2 两个基因，前者 pre-miRNA 剪切，后者主要参与 siRNA 形成 (Lee et al., 2004b)。
图 1.3 miRNA 剪切成熟相关基因结构示例(Kim, 2005)Fig.1.3 genes involved in miRNA biogenesis植物 miRNA 的产生机制与动物相比略有不同 (Chen, 2005)。首先，植物中不存在 Drosha 与 DGCR8/Pasha 基因。其次，植物中 pri-miRNA 长度长于动物pri-miRNA，而 pre-miRNA 尚未被大量鉴定，因此结构尚不明确 (Reinhart et al.,2002)。有报道认为，植物中存在 个 Dicer 酶同源基因 DCL1，具有类似 Drosha及 Dicer 的功能，即在细胞核内通过剪切 pri-miRNA 形成 miRNA 双链复合体(Reinhart et al., 2002)。形成的 miRNA 双链复合体再经过 Exportin-5 同源基因HASTY 转运至细胞质中 (Bollman et al., 2003; Park et al., 2005)。细胞质中的miRNA 双链复合体最终在解旋酶的催化下，形成 miRNA 成熟体（图 1.4）。随着高通量测序技术在 miRNA 研究中的广泛应用，人们发现不同物种间既
本文编号：2794411
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：
2图 1.1 动物 miRNA 转录及调控机制模型(He and Hannon, 2004)Fig 1.1 the Biogenesis and Function of Animal miRNA实际研究中对 miRNA 的界定通常还需要参考以下几个标准 (Kim, 2005)。首先是 miRNA 的表达水平， 般情况下 miRNA 的存在需要经过 Northern blot 验证，或者经过 RT-PCR、miRNA 芯片，二代测序等证实。尤其是 Northern blot实验被认为是验证 miRNA 成熟体或前体序列的经典方法；随着大规模测序技术成本的降低，基于高通量测序技术的方法逐渐成为鉴定 miRNA 的主流方案。其
miRNA 在长牡蛎环境胁迫应答中的调控作用的突出 (Gwizdek et al., 2003; Zeng and Cullen, 2004)。转运至细胞iRNA 将会在 RNA 酶 III Dicer 的催化下进 步剪切，脱去环状结构，NA 双链复合体（miRNA duplexes） (Hutvágner et al., 2001; Knight and)。miRNA 双链复合体极不稳定，在果蝇中能够受到 Dicer-R2D2 催化链选择（strand selection）形成成熟的 miRNA 序列 (Liu et al., 2003)。NA 成熟过程中重要的 RNA 酶，Dicer 广泛存在于几乎所有真核生物中同物种中可能具有多个同源基因，并行使不同的功能 (de Jong et al., herjee et al., 2013)。如，果蝇中存在 Dicer-1 与 Dicer-2 两个基因，前者 pre-miRNA 剪切，后者主要参与 siRNA 形成 (Lee et al., 2004b)。
图 1.3 miRNA 剪切成熟相关基因结构示例(Kim, 2005)Fig.1.3 genes involved in miRNA biogenesis植物 miRNA 的产生机制与动物相比略有不同 (Chen, 2005)。首先，植物中不存在 Drosha 与 DGCR8/Pasha 基因。其次，植物中 pri-miRNA 长度长于动物pri-miRNA，而 pre-miRNA 尚未被大量鉴定，因此结构尚不明确 (Reinhart et al.,2002)。有报道认为，植物中存在 个 Dicer 酶同源基因 DCL1，具有类似 Drosha及 Dicer 的功能，即在细胞核内通过剪切 pri-miRNA 形成 miRNA 双链复合体(Reinhart et al., 2002)。形成的 miRNA 双链复合体再经过 Exportin-5 同源基因HASTY 转运至细胞质中 (Bollman et al., 2003; Park et al., 2005)。细胞质中的miRNA 双链复合体最终在解旋酶的催化下，形成 miRNA 成熟体（图 1.4）。随着高通量测序技术在 miRNA 研究中的广泛应用，人们发现不同物种间既
本文编号：2794411
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