草鱼基因组ENU诱变研究及重复fgfrll、igfbp-5基因的克隆和功能分析

发布时间：2020-08-23 20:31

【摘要】：草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为我国淡水经济鱼类中产量最大的种类,其性成熟个体较大(10kg),性成熟周期较长,目前还没有育成优良品种。传统的育种方式需要较高的成本和较长的时间,草鱼基因组中存在大量未知功能的主效基因,解读它们的功能对认识草鱼生殖、生长、发育及抗逆(病)等经济性状具有重要的理论意义和应用价值。化学诱变已经广泛应用于农作物和蔬菜育种中,由于鱼类体外受精的特点,使其能够在不同时期开展诱变获得突变体。目前,鱼类化学诱变主要采用突变能力强的烷化剂。在模式生物斑马鱼中,ENU诱变能够产生各式突变性状的功能突变体。ENU化学诱变应可用于养殖鱼类的遗传育种,以增加养殖鱼类的基因遗传突变率。本研究以0.1~2.0mmol等不同浓度的ENU溶液处理草鱼受精卵15min,在胚胎体节期的畸形率分别为20.3%~78.5%,胚胎畸形率与ENU浓度成正相关;出苗存活率则从86.3%~17.2%,与ENU浓度成负相关。最后选用0.5mmol浓度ENU溶液处理大量处理受精卵,受精后产生的子代在体节期胚胎畸形率约为50%,约50%的子代形态发育正常,生长速度产生差异,可供筛选出性状优良的突变个体。通过提取20尾1+龄诱变F1子代的基因组DNA,对4个生长发育通路相关基因mstn-1、mstn-2、fst-1、fst-2的部分阅读框进行基因组DNA的PCR扩增和测序。结果显示,ENU能够高效诱导草鱼基因组产生单核苷酸突变,ENU对上述4个基因的平均诱变率为0.13%,表明ENU溶液浸泡受精卵可提高草鱼基因组突变效率,进而应用于草鱼的遗传改良。成纤维细胞生长因子受体类似物1(Fibroblast growth factor receptor like 1,FGFRL1)是近期发现的FGFRs家族中的一员。FGFRL1是一类缺少细胞内酪氨酸激酶结构域的生长因子受体,研究表明它在细胞增殖、肌肉骨骼系统发育等方面有重要的作用。本研究采用c DNA末端快速扩增法(RACE)克隆了草鱼fgfrl1a/-1b重复基因全长c DNA序列。草鱼fgfrl1a和fgfrl1b基因全长分别为3405bp和2666bp,开放阅读框分别为1461bp和1458bp,可分别编码486个和485个氨基酸残基。与人类和斑马鱼一样,草鱼成熟Fgfrl1a和-1b多肽也包含三个Ig-like结构域,一个跨膜结构域,两个酪氨酸残基和一个富含组氨酸的细胞内位点。它们都含有6个保守的半胱氨酸残基。草鱼Fgfrl1a和-1b的编码区与斑马鱼的相比相似度分别为96%和91%,与人类FGFRL1的相似性较低(分别为66%和59%),但它们之间的相似度仅为56%。实时荧光定量PCR结果表明,草鱼fgfrl1a和-1b基因都在胚胎发育的受精卵时期有表达,随着体节发育时期而表达量上升,然后呈现下降趋势。在成年草鱼中,fgfrl1a和-1b在所有组织中表达,但组织表达差异较大,fgfrl1a m RNA在脑、心脏和肌肉中表达丰富,而fgfrl1b m RNA则在眼、肌肉和鳃中表达量高。整胚原位杂交结果显示,在草鱼fgfrl1a m RNA主要在胚胎的脑等神经组织和脊索体节等外胚层和中胚层细胞组织表达,而fgfrl1b的m RNA在晶状体和内胚层表达。饥饿处理幼年草鱼6天,然后恢复投喂的实验发现,fgfrl1a和-1b m RNA在肌肉和脑中都在饥饿过程中表达量升高,第6天达到最高,随着恢复投喂渐渐回到正常水平。h GH处理实验显示,fgfrl1a和-1b m RNA表达量都降低,且降低幅度与注射浓度成正相关。本研究为深入探索草鱼重复fgfrl1s基因的功能和分子育种奠定了一定的理论基础。IGFs在进化过程中具有高度保守的特点,尤其在胚胎、神经和骨骼肌的生长发育,细胞的增殖和转化等方面有重要作用。IGFBP-5(Insulin-like growth factor binding protein-5)是IGFBP-家族中最保守的成员,是一个多功能分泌型蛋白质,能够增强IGF的功能。本文利用实时荧光定量PCR实验对草鱼成鱼不同组织igfbp-5s基因表达量进行研究,所有检测的组织中igfbp-5a m RNA在肝脏中表达量最高,其次是脑,在肾脏和眼睛中表达较高;而igfbp-5b m RNA在所有组织中均有表达,其中在肌肉、肾脏、肝脏、脑和眼睛中表达量相对较高,其他组织表达量较低。草鱼整胚原位杂交结果显示,igfbp-5a m RNA在胚胎发育过程中主要在体节和脑中表达,而igfbp-5b m RNA在脊索,体节和脑中表达明显。同样利用饥饿及恢复投喂实验的方法,igfbp-5a和-5b m RNA在不同组织中呈现不同趋势,在肝脏和肌肉中随着饥饿表达量升高而后恢复,在脑中是先降低后升高至正常水平。注射外源h GH后,肌肉中igfbp-5a和-5b m RNA表达升高,脑中降低。明显的组织差异说明igfbp-5a和-5b存在功能差异,为进一步研究其功能及IGF信号通路奠定理论基础。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：

诱变,F1代,形态类型,异常发育

10图 1-1 ENU 诱变后 F1 代孵化期胚胎异常发育的形态类型Fig. 1-1 Morphological defects of ENU-treated F1 embryos at hatching stage.1.2.2 ENU 诱变 F1 代突变位点的检测和诱变频率对 F1 子代进行 ENU 诱变突变位点和诱变频率的检测，每组分别提取来自 20尾 1+龄 ENU 诱变 F1 子代和 5 尾对照组的基因组 DNA。检测基因为 fst-1、fst-2、mstn-1、mstn-2 等 4 个草鱼肌肉生长发育相关基因，利用根据其部分阅读框设计的引物进行 PCR 扩展，电泳检测清晰（图 1-2），进行双向测序。测序结果显示突变位点数量和 20 个个体的突变率如表 1-4。在 fst-1、fst-2、mstn-1 和 mstn-2 扩增的长度分别为 196bp、173bp、356bp、329bp 的片段中，突变位点的数量在突变的 F1 代 20 个个体中分别为 7 个、4 个、9 个、6 个，单个基因的突变位点数平均

电泳图,诱变,F1代,电泳图

频率为 0.13%；对照组的 F1 子代检测中未发现点突变（表 1-4）。序列分析显示，经过 ENU 诱变产生的突变位点在基因组 DNA 中主要有以下几种形式，有 54%（14/26）产生了 A-T 到 G-C 的转换、42%（11/26）为 G-C 到 A-T 的转换、4%（1/26）产生了 G-C 到 C-G 的颠换（图 1-3，部分结果未显示）。

诱变,基因突变,F1代,位点

图 1-3 ENU 诱变 F1 代 mstn-1 和 mstn-2 基因突变位点检测。A：mstn-1 基因序列，B：mstn-2 基因序列Fig 1-3 Mutation sites at the mstn-1 and mstn-2 locus1.3 讨论草鱼是我国第一大养殖淡水鱼类，目前为止还没有优良品系，草鱼育种的目标是培育出高产、抗逆的优良品种。化学诱变已经广泛应用于农作物的育种中，且培育出大量新品种。ENU 作为高效的化学诱变剂在模式动物中已展开不少研究，如在斑马鱼[76]和非洲爪蟾[77]中利用获得的突变体对功能基因及胚胎发育机制的研究已取得一定成果，通过 ENU 诱变得到 myostatin 基因缺失的青淏出现肌纤维肥大及增生的双肌型[78]，为研究 myostatin 基因的功能提供了有利突变体。然而在水产养殖鱼类中缺少相应的实践及成果。只有前苏联[10]曾采用 ENU 诱变结合雌核发育的技术获得了鲤鱼优良突变品系。国内韩启霞[15]等利用 ENU 浸泡方正银鲫雌雄亲本研究 F1 代的诱变率，蒋霞云[16]等已利用 ENU 浸泡草鱼精子的方法获

【参考文献】