金钱鱼雌雄性腺转录组分析及性类固醇激素水平的研究

发布时间：2020-08-23 21:48

【摘要】：金钱鱼(Scatophagus argus)作为一种兼具食用和观赏价值的重要养殖鱼类,具有典型的雌雄性别二态性特征。其雌雄生长差异明显,雌鱼生长快、个体大,养殖效益好,而雄鱼生长慢、个体较小,体色艳丽,观赏价值高。金钱鱼雌雄发育不同步,雌鱼卵巢成熟时间比雄鱼精巢晚,人工繁殖中难以保证雌雄鱼同步性成熟,催产效率低。性别二态性作为在有性繁殖动物中普遍存在的一种生理现象,其形成的部分原因可能与机体不同基因的差异表达、性类固醇激素的差异水平和摄食习性等有关,是多种因素共同参与协调的复杂生长发育过程。鱼类雌雄性腺具有不同的发育特征,性别决定后开始分化为精巢或卵巢,使鱼类的性腺内部结构和外部形态表现出明显的性别二态性,基因表达也具有明显差异。大量研究集中在筛选鱼类性腺差异表达mRNA。本文通过金钱鱼性腺转录组测序,从mRNA水平探索精巢和卵巢差异表达的基因和富集的信号通路,测定血清中性类固醇激素水平,分析性类固醇激素合成相关基因及其受体基因在不同发育时期的表达特征。初步回答了血清中性类固醇激素水平差异的原因,为最终解析雌雄二态性可能的分子机理提供基础数据。其主要结果如下:1、金钱鱼性腺转录组分析,差异表达基因和信号通路的筛选利用RNA-seq技术对金钱鱼发育成熟的III期精巢(n=3)和卵巢(n=3)进行高通量测序,在金钱鱼雌雄性腺构建了cDNA文库。经de novo拼接组装后,获得136,561个unigene,其与数据库比对获得大量注释信息。通过差异筛选条件(|log_2FoldChange|≥2,P-values0.01)得到32,122个差异表达基因,其中11,156(34.73%)个在精巢中高表达,20,966(65.27%)个在卵巢中高表达。选择了20个显著的差异表达基因进行定量验证,发现其表达水平与转录组结果一致,证实转录组数据可信。根据数据库注释结果及在其他鱼类的相关研究,进一步筛选到73个已知功能的性腺差异表达基因,其中雄性高表达的53个,如dmrt1,amh,gsdf,wt1a,sox9b和nanos2等;雌性高表达的20个,如foxl2,sox3,gdf9,bmp15,zar1和figla等。另外,通过基因数据库比对,筛选到重要的与性别相关的功能分类信息,包括性别分化(sex differentiation),有性生殖(sexual reproduction),生殖过程(reproductive process),配子形成(gamete generation)和性腺发育(gonad development)等;且富集到与性别相关的信号通路,包括类固醇激素生物合成(Steroid hormone biosynthesis),卵巢类固醇生成(Ovarian steroidogenesis),PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway),胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)和FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)等信号通路。2、雌雄鱼不同发育时期血清中性类固醇激素水平测定了17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、11-酮基睾酮(11-ketotestosterone,11-KT)和睾酮(Testosterone,T)在雌鱼II、III、IV期和雄鱼III、IV、V期血清中的水平。结果表明E2水平在雌鱼不同发育时期均明显高于雄鱼,且随着发育时期变化其水平呈现递增的趋势,在雌鱼IV期达到最高水平(0.80 ng/mL)。11-KT水平在雄鱼不同发育时期均高于雌鱼,且随着发育时期的变化而逐渐升高,在雄鱼V期达到最高水平(0.47 ng/mL)。T水平在雌鱼中高于雄鱼,且在雌鱼各个发育时期的水平均比雄鱼高,在雌鱼IV期达到最高水平(0.41 ng/mL)。T作为合成E2和11-KT的前体物,在E2和11-KT的合成过程中可能起着平衡调节作用。雌鱼中E2的高水平和雄鱼中11-KT的高水平可能对于维持各自的雌、雄鱼性别特征有着重要作用。推测金钱鱼可能受雌、雄激素相对水平的影响进而调控个体生长。3、性类固醇激素合成相关基因及其受体基因在性腺不同发育时期的表达从转录组拼接结果中筛选出19个重要的与性类固醇激素合成通路相关的基因及其受体基因,分别在卵巢II、III、IV期和精巢III、IV、V期进行mRNA定量验证,发现其在雌雄性腺不同发育时期的表达水平有着明显的性别差异性。其中StAR1,StAR2,cyp11a1,cyp11b2,cyp19a1b,hsd11b2,hsd3b1,hsd3b7,ar,erα,erβ1和erβ2基因的表达水平在精巢各个时期均高于卵巢;而cyp19a1a,hsd17b1,hsd17b8,hsd17b12和hsd17b14基因的表达水平在卵巢各个时期均高于精巢。其中,cyp11b2作为催化T转化为11-KT的关键基因,其在雄性中的高表达可能促使11-KT在雄鱼中的高水平。而芳香化酶基因cyp19a1a在雌鱼各个时期的高表达,促使T转化为E2,使雌鱼保持较高的E2水平。推测性类固醇激素合成相关基因及其受体基因的差异表达水平可能是导致雌雄个体生长差异的原因之一,金钱鱼的性类固醇激素合成相关基因及其受体基因可能参与调节雌、雄激素水平而影响雌、雄鱼的生长与生殖过程。本研究是首次对金钱鱼性腺转录组进行测序和分析,该结果为进一步研究金钱鱼的性别调控机制和分子特征提供了基础的参考,并为水产养殖中金钱鱼的性别控制和繁殖发育提供了一些基础的数据支持。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

序列,转录组,生物信息,质控

图2-1转录组生物信息研究流程Fig.2-1 Transcriptome de novo bioinformatics research process2.1.2.4 原始数据质控和过滤测序平台将测序结果图像信号转换成文字信号，并将其以 FASTQ 格式储存起来作为原始数据（Raw reads）。过滤低质量的 Reads 以保证后续分析结果的可靠性。过滤条件如下：1) 去掉包含接头的序列；2) 去除 N 碱基比例超过 5%的序列；3) 去除包含 50%以上的碱基质量值小于 10 的序列；最后，过滤后得到 Clean Read，并用于后续分析。2.1.2.5 De novo 拼接和组装由于目前尚无金钱鱼基因组信息，其转录组数据将进行 De novo 组装拼接，并以拼接得到的序列作为后续分析的参考序列。使用组装软件 Trinity 对去重复的 Cleanreads 进行组装。Trinty 组装主要分为：①Inchworm；②Chrysalis；③Butterfly 3 个步

量计,基因表达,流程,功能注释

图2-2组装流程Fig. 2-2 Assembly procedure2.1.2.6 基因表达量计算本研究的基因表达水平计算方法采用目前较为常用的 FPKM ( Fragment Per Kibases per Million Reads )[149]，即每百万 Reads 中来自某一基因每千碱基长度fragment 数目。FPKM 同时考虑了基因长度和对测序深度 Reads 计数的影响。其计算公式如下：其中，C 为唯一比对到基因的 fragment 数，N 为唯一比对到参考基因的总fragment 数，L 为基因的碱基数。2.1.2.7 Unigenes 功能注释将得到的所有 unigenes 通过 Blast 比对数据库进行功能注释[150]，注释数据库包括：NCBI Nt (non-redundant nucleotide)/Nr (non-redundant protein)、基因本位(GeOntology, GO)、直系同源家族蛋白数据库(Clusters of Orthologous Groups, COG)、

序列长度分布,海洋大学,硕士学位论文,广东

广东海洋大学硕士学位论文表2-2 De novo组装结果Table 2-2 De novo Assembly resultsAssembly NumberTotal number of unigenes 136561Min sequence length (bp) 200Max sequence length (bp) 22202Mean sequence length (bp) 1389.72N50 assembled transcripts length (bp) 3038N90 assembled transcripts length (bp) 496Assembled transcripts %G add %C 46.63

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