养殖凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）细菌性白斑病的发生及其病原学病理学研究

发布时间：2020-09-07 16:13

　　凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国对虾的主养殖品种,随着养殖的深入开展,其产量近几年高居世界首位,为我国沿海乃至内陆地区的农业经济发展做出了突出贡献。然而,产业的发展也伴随着病害的发生。本文主要针对一种新型的对虾细菌性白斑病(Bacterial white spot disease,BWSD)进行了深入研究。2015~2016年,对浙江、河北、山东、江苏、天津五省市共9地区出现白斑症状的凡纳滨对虾150余口养殖池进行了调查,出现白斑症状的对虾检出率达84.7%。对调查中存在白斑症状的对虾进行取样,参照GB/T 28630.2-2012白斑综合症(WSD)诊断规程中套式PCR检测法,进行WSSV检测排查,各地甲壳上具有明显白斑的患病对虾均未被WSSV感染。调查发现养殖水温在26℃以上均有细菌性白斑病的发生,其发生不受养殖模式的影响,室外大塘、室外高位池、室外保温棚以及室内循环水工厂化四种主要养殖模式中均有检出。由于凡纳滨对虾一年四季均有养殖,养殖水温在26℃以上,故细菌性白斑病在一年四季均可发生。肉眼观察下,患细菌性白斑病(BWSD)对虾头胸甲出现的白色斑点与对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后的白斑极为相似,但不同的是,患细菌性白斑病初期,对虾健康状况良好,生长基本正常,活力比较旺盛,未出现明显死亡现象,而患病毒性对虾白斑综合征属急性死亡,2~3天内死亡率可达100%。由于养殖业者缺少区分细菌性白斑病和病毒性白斑综合征的技术,当白斑发生时往往采取消极措施,甚至紧急排塘,结束养殖,造成不必要的损失。本文对细菌性白斑病的组织病理学进行了研究。光学显微镜下观察,细菌性白斑呈圆形,具明显辐射肋,由白斑中心延伸至锯齿状的边缘;白斑的中心处通常呈暗褐色,后期此处虾壳被侵蚀穿孔;而由WSSV感染引起的白斑呈圆形,边缘光滑、规则,圆形中密集分布大量黑色小斑点,无明显中心。细菌性白斑病白斑处的组织病理学研究显示,白斑中心虾壳被细菌破坏、分解,壳下充满大量组织碎片和细菌,上皮组织以及结缔组织被严重破坏、侵蚀,出现断裂,最终在整体结构上形成明显凹陷与断层;高倍镜下观察发现,断裂的上皮组织与结缔组织得细胞核呈嗜碱性深染,壳下上皮组织与结缔组织伴有炎症、甚至坏死。电子显微镜下,细菌性白斑中心区域甲壳被细菌侵蚀,出现穿孔,穿孔四周甲壳呈絮状,并有大量的杆状细菌黏着、积聚。同时,白斑周围的健康甲壳也有大量杆状细菌附着。研究结果为区分细菌性和病毒性白斑奠定了基础。本研究从浙江、山东(2015年)、河北、天津、江苏和山东(2016年)患病对虾样品中的头胸甲白斑中心区域分离获得6株优势度达80%以上的优势菌,编号分别为ZJ201506、SD201508、HB201509、TJ201509、JS201510、SD201601。通过革兰氏染色、生理生化反应以及基于16s rDNA与基于gyr B的序列分析最终确定6株优势菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或其后期异型菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);药敏实验结果为:6株优势菌对氧氟沙星、菌必治、头孢氨苄、盖博斯林、苯唑青霉素、头孢噻肟高度敏感;对青霉素、利福平、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素不敏感。利用菌株JS201506对健康的凡纳滨对虾进行浸浴感染,浸浴浓度为5×102~5×106cfu/mL。同时设置创伤浸浴感染实验组,使用解剖刀对受试对虾甲壳进行创伤处理,以留下划痕不穿透为原则,创伤实验组浸浴浓度为5×104cfu/mL和5×105cfu/mL。结果显示,实际检测浓度为2×104cfu/mL感染组的受试对虾于27d出现与自然患病对虾相同的早期细菌性白斑;检测浓度为6.7×105cfu/mL感染组和9.1×105cfu/mL感染组分别在12d和10d出现早期白斑,在29d和25d时出现中、后期白斑。创伤实验组对虾头胸甲上均出现了沿创伤部位生长的白斑,且白斑较为明显,以上患病对虾均表现出活力正常,摄食状况良好,未出现明显死亡。因此,当水体中的解淀粉芽孢杆菌浓度高于104cfu/mL时,对虾存在感染细菌性白斑病的风险。从回感患病对虾白斑中心区域进行细菌分离得到一株优势度为87.1%的细菌,该菌革兰氏阳性,杆状,具芽孢。通过生理生化和16s r DNA的序列分析得出结论,分离的优势菌与菌株JS201506为同一株菌。本研究使用市场销售的3种不同品牌的以芽孢杆菌为主要成分菌的微生态制剂粉末充氧活化后,对健康凡纳滨对虾进行高浓度浸浴实验,施用量按照指导用量的4~5倍。结果显示:3种微生态制剂感染受试健康对虾分别在16d、20d和18d时,甲壳出现了典型的细菌性白斑症状,而受试对虾摄食状态良好,未出现死亡现象。因此,市售以芽孢杆菌为主要成分菌的微生态制剂高浓度施用会导致细菌性白斑病,故养殖过程中应合理的使用微生态制剂。综上,本文研究病毒和细菌两种对虾白斑症状的不同,正确的区分了细菌性白斑病与病毒性白斑综合征,对开展对虾健康养殖和相关病害防控具有重要的指导意义。通过对浙江、山东、河北、天津、江苏五省市对虾细菌性白斑病调查和致病原分析,发现解淀粉芽孢杆菌或其后期异型菌贝莱斯芽孢杆菌是的主要致病原,并且该病的发生与以芽孢杆菌为主要成分菌的微生态制剂过量施用存在关联。同时,本论文所得结论也为提高水产养殖的生态安全意识和正确使用微生态制剂提供了理论依据。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S945.49

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