鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA疫苗、卵黄抗体的研制及鱼卵中鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测技术

发布时间：2020-09-08 13:45

　　 鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus II,CyHV-2)是鲤疱疹病毒属中一种具有强致病力的DNA病毒。近年来,由CyHV-2引起的异育银鲫鳃出血病在江苏盐城地区大规模爆发,致死率特别高,给异育银鲫的养殖业带来巨大损失,生产上亟待开发安全高效的新型疫苗,应用于异育银鲫鳃出血病防治。1.CyHV-2新型疫苗的免疫效果评估本研究中基于杆状病毒表面展示系统构建了CyHV-2的ORF72与ORF66重组疫苗、CyHV-2的ORFD4核酸疫苗,并评估它们抗CyHV-2的免疫效果。将CyHV-2_ORF72基因与CyHV-2_ORF66基因分别克隆进杆状病毒表面展示载体pFastBac~(TM)Dual-P10-GP64CTD载体中,通过Bac to Bac系统获两种重组病毒,命名为BmNPV-P10-GP64-ORF72与Bm NPV-P10-GP64-ORF66。以1.0×10~(10)TU/尾的病毒量分别腹腔注射免疫异育银鲫(体长7~13cm,体重35-60g),同设免疫等体积的生理盐水作空白对照组,免疫后第3周通过竞争型酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血液中抗体的效价水平。结果显示免疫组(2组)与对照组抗体效价水平没有明显差异。表明基于杆状病毒表面展示系统构建的CyHV-2的ORF72与ORF66重组疫苗免疫异育银鲫后,机体均没有产生较高水平的特异性应答。因此,选取CyHV-2(GenBank:KT387800)的衣壳蛋白(ORF66、ORF72)和膜囊蛋白(ORF81、ORF82)作为候选疫苗蛋白,通过抗原表位预测后,将ORF66、ORF72、ORF81、ORF82的抗原表位对应的DNA序列串联,将经密码子优化后的序列克隆在β-肌动蛋白启动子下游,构建重组杆状病毒转移载体,通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒,命名为BmNPV-FA-D4ORF。分别以注射和口服的方式免疫异育银鲫(体长7~13cm,体重35-60g)。Bm NPV-FA-D4ORF通过腹腔注射免疫异育银鲫(2.2×10~(13)TU/尾),同设BmNPV为阴性对照及空白对照组(等体积生理盐水/尾)。在鱼免疫后第1、2、3周通过PCR、RT-PCR的方法检测免疫鱼体中相关疫苗基因的DNA、RNA水平;免疫后第1、2周后,通过免疫组化的方法检测免疫鱼体脾脏、肾脏中疫苗基因蛋白水平的表达;免疫后第1、2、3、4周分别通过竞争型-ELISA检测抗体效价水平;免疫后第3周接种CyHV-2,评估免疫效果。结果显示,BmNPV-FA-D4ORF注射鱼体后能够进入鱼组织,表达疫苗蛋白,并刺激鱼产生特异性抗体,抗体水平在注射后的第三周达到最高水平。攻毒后,免疫组、阴性对照组、空白对照组的鳃出血病的发病率分别为7.69%、29.17%、38.46%。滴度为2.2×10~(11)TU/ml的Bm NPV-FA-D4ORF以1ml/g喷洒鱼颗粒饲料(对照组中添加等体积生理盐水),饲喂异育银鲫,4周后,人工感染CyHV-2免疫组、空白对照组的鳃出血病的发病率分别为15.38%、25.93%。表明BmNPV-FA-D4ORF通过注射和口服的方式免疫,均对异育银鲫鳃出血病有良好的免疫保护作用。将异育银鲫浸泡免疫在500拷贝的BmNPV-FA-D4ORF/μl的水中,5h后取鳃、脾脏、血液进行RT-PCR检测,发现浸泡免疫鱼的脾脏、脾脏、血液中均检测到了疫苗基因表达,表明BmNPV-FA-D4ORF可以通过浸泡进入鱼体,并表达疫苗基因,暗示BmNPV-FA-D4ORF可以通过浸泡免疫异育银鲫。2.CyHV-2的ORF72蛋白卵黄抗体的制备为了探讨卵黄抗体应对异育银鲫鳃出病的防治效果,将CyHV-2的ORF72基因克隆进PET28+(a)的载体中,然后在大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE和Western-blot检测结果显示,ORF72在大肠杆菌中成功表达,表达水平较高。筛选出高表达阳性克隆菌,再接种至发酵罐中放大培养后,收集菌体,通过破碎、变性、复性、过Ni柱、洗脱、透析等一系列过程,从大肠杆菌中纯化获得可溶性的ORF72蛋白;通过免疫鸡群,收鸡蛋制备蛋粉共获蛋粉约100千克。Western-blot检测结果显示,蛋粉中含有特异性的ORF72抗体,ELISA检测结果显示,蛋粉中的抗体效价在1:8000-16000,为测试卵黄抗体在鳃出血病防控中的效果奠定了基础。3.异育银鲫鳃出病鱼卵中的CyHV-2的检测基于CyHV-2的解旋酶基因(helicase)设计了引物,建立real time PCR检测CyHV-2的技术。对患病异育银鲫不同组织的检测结果显示,异育银鲫的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃的感染CyHV-2的程度存在显著差异,肾脏感染程度最高,其次是脾脏和鳃,心脏的感染程度最低。鱼卵逐粒检测结果显示,病鱼的鱼卵中,有12.5%可检测到CyHV-2。病鱼的鱼卵的集团检测结果显示,带毒量为3.31拷贝的病毒/粒鱼卵。对不同感染程度的病鱼的鱼卵检测结果显示,卵中CyHV-2的检出水平与鱼的感染程度呈一定的弱正相关性。这些结果表明CyHV-2可通过卵垂直传递给子代。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S941.41
【部分图文】：

鲤疱疹病毒 II 型的 DNA 疫苗、卵黄抗体的研制及鱼卵中鲤疱疹病d-GP64-ORF66。为了验证重组 Bacmid 中具有 ORF72 和 OR物对 Bacmid-GP64-ORF72 和 Bacmid-GP64-ORF66 进行 PCR以从 Bacmid-GP64-ORF72 和 Bacmid-GP64-ORF72 扩增出与异性条带（图 1），分别为泳道 2 转化菌与泳道 4 转化菌，说重组至 Bacmid 中。

-P10-GP64-ORF72、Bacmid-P10-GP64-ORF66 转染 BmN 下观察细胞和转染 Bacmid-P10-GP64-ORF72 的 BmN 细胞，B：正常 BmBacmid-P10-GP64-ORF66 的 BmN 细胞 Western 检测重组蛋白 ORF72、ORF66 在病毒粒子中的：Bacmid-P10-GP64-ORF72 转染 BmN 细胞后 3d 收上清超速离心kDa

23测重组蛋白 ORF72、ORF66 在10-GP64-ORF72 转染 BmN 细胞后 ORF66 转染 BmN 细胞后 3d 收上清鼠抗，CyHV-2-ORF66 自制鼠抗；鼠P64-ORF72 与 BmNPV-P10-GP4-ORF72 与 BmNPV-P10-GP64-的鱼血作阴性对照，通过反竞

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本文编号：2814247