一株新型戊糖片球菌的筛选及其对鱼类抗病性的影响

发布时间：2020-09-08 15:02

　　近年来利用益生菌作为饲料添加剂是淡水鱼类生态养殖上防控细菌性病害的有效新方法。本研究从海南三亚土壤中筛选获得一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)新菌株,命名为戊糖片球菌SL001,并研究了该菌株的生物学特性、对草鱼抗病性及生长与免疫力的影响以及基因组特征,主要研究内容和结果如下:从海南三亚土壤中筛选到一株对鱼类病原菌具有广谱抑菌活性的乳酸菌,命名为SL001。根据形态学特征、生理生化特征以及16S rRNA基因测序鉴定,该菌株为戊糖片球菌(P.pentosaceus)新菌株。检测了SL001菌株的抑菌活性,发现该菌株对鱼类病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloide)及格式乳球菌(Lactococcus garvieae)均具有较好的抑菌效果。研究中发现SL001菌株细胞对80℃高温、壮观霉素等多种抗生素和氧气具有一定的耐受性。经细胞培养试验表明,SL001菌株对草鱼肝脏L8824细胞系无毒害作用。SL001菌株发酵上清液中,抑菌活性物质对高温和蛋白酶均不敏感,且乳酸浓度随着培养时间的增加而增加,最高可达12.4 mmol/L。乳酸含量为0.3 mL、6.14 mmol/L时的发酵液可完全抑制嗜水气单胞菌的生长。为了研究SL001菌株的益生功能,对草鱼饲喂含有1×10~9 CFU/g SL001菌株的饲料30天。利用Illumina MiSeq平台对草鱼肠道微生物组测序分析的结果显示,厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)是试验组和对照组中的优势菌群。潜在益生菌片球菌属(Pediococcus)在试验组中的丰度显著高于对照组,而试验组中潜在病原菌,如气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)的丰度显著低于对照组,SL001菌株能在草鱼肠道中稳定定殖。饲喂SL001菌株30天后,草鱼体重增长率和比生长率显著高于对照组;对试验草鱼的肠道组织HE染色分析,发现与营养物质消化吸收有关的杯状细胞明显增多,肠道绒毛显著增长。试验组草鱼中肌肉抑制素(MSTN-1,MSTN-2)表达量显著下调,胰岛素样生长因子(IGF-1,IGF-2)表达量显著上调。试验组草鱼血清中酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性均显著高于对照组。试验组草鱼肝脏、脾脏中IgM和补体C3的表达量显著高于对照组,而IL8显著低于对照组。上述结果表明SL001菌株能促进草鱼的生长和提高其免疫力。攻毒试验表明,SL001菌株能显著降低嗜水气单胞菌感染后草鱼的死亡率。对戊糖片球菌SL001基因组进行分析,基因组全长为1,919,175bp,由1,842,476 bp的核基因组和76,699 bp的质粒基因组组成。预测到了1,889个CDS,2个CRISPR元件。借助COG、GO、KEGG功能注释和RAST注释,发现大部分基因与碳代谢、蛋白质和氨基酸代谢、核苷酸代谢以及膜转运过程有关。通过比较基因组分析发现,在基因家族分析中,SL001菌株基因组和同种其他不同菌株存在明显的差异;利用antiSMASH在线软件分析了SL001菌株中次级代谢产物基因簇,有2个次级代谢产物基因簇被预测到,其中一个基因簇与抗菌凝固素(coagulin)合成基因簇有40%的相似性,推测可能为抗菌凝固素中新成员。综上所述,本研究分离筛选到的戊糖片球菌SL001菌株经分类鉴定和基因组测序比较,显示为一株新菌株,该菌对草鱼抗病性显示出很好的抗病作用,并能促进草鱼生长和提高其免疫力。从基因组功能注释发现可能含有抗菌凝固素生物合成基因簇,表明利用该菌株作为益生菌用于饲料添加剂在鱼类养殖生产上具有潜在的应用价值。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S942
【部分图文】：

种类,草鱼,病害,锦鲤

罗非鱼、团头鲂、大鲵、黄金卿鱼、锦鲤等多种淡水鱼类患病[9-11]，主要发状为体表充血、局部溃烂、腹部肿大、肛口红肿，解剖内部器官肿大、颜色、腹腔严重积水、肠液黏连、肠道无食、肠壁充血，感染严重的鱼各器官坏死胞发生溶血，难以分辨各器官[12, 13]。同时也有相关报道，这类细菌能够引类和哺乳类的腹泻和败血症，是人-鱼共患的病原菌，对人类健康产生巨大胁[14]。荧光假单胞菌可引起草鱼、罗非鱼、锦鲤、大鲵等多种水产动物患病，病鱼体表出现严重的出血、炎症、鳞片脱落等症状[15-17]。湖南作为全国鱼类养殖大省，以草鱼养殖为主，“烂鳃病、肠炎病、赤皮病”和“细菌性症、病毒性出血病、肝胆综合征”分别被称为草鱼养殖中的“老三病”和“病”，这些病害一旦发生，极难控制，将会导致严重的经济损失[18]。贝类病害7%藻类病害3%棘皮类病害2%

疫苗生产,水产养殖,芽胞杆菌,平台

一株新型戊糖片球菌的筛选及其对草鱼抗病性的影响比较成熟，与其他种类益生菌相比，芽胞杆菌的芽胞具有耐高温、耐酸碱、耐干燥等特点。我国水产养殖允许使用的芽胞杆菌主要有枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、贝莱斯芽胞杆菌、东洋芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和坚强芽胞杆菌等[40]。Yi 等人从健康草鱼中筛选了一株贝莱斯芽胞杆菌，通过研究，该菌株对鱼类病原菌具有广谱的抑菌活性，同时能诱导鱼体免疫相关基因表达上调，刺激鱼体的免疫应答，对鱼类具有保护作用[41]。曹海鹏的研究证实了解淀粉芽胞杆菌能够治疗嗜水气单胞菌引起的草鱼细菌性败血症[42, 43]。杨丽莉等研究了枯草芽胞杆菌发酵产生的脂肽类物质对嗜水气单胞菌的抑制效果，发现嗜水气单胞菌对脂肽类物质具有较高的敏感性，丰富了枯草芽胞杆菌的抑菌机理[44]。目前水产养殖用乳酸菌和酵母菌的研究较少，因此开发新的水产动物功能微生物来降低水产养殖病害损失和提高水产品质量迫在眉睫。

乳酸菌,病原菌,肠道

一株新型戊糖片球菌的筛选及其对草鱼抗病性的影响长（图 1-3）[56]。小片球菌 2.6 菌株产生 β-葡聚糖，能帮助菌体定殖于鱼类肠道，限制病原菌鳗弧菌吸附于肠道[39]。另外，当乳酸菌进入肠道后，利用宿主摄入食物的营养物质生长繁殖，并和病原菌竞争营养从而限制病原菌生长，同时消耗氧气，使好氧病原菌无法生长[19]。所以，乳酸菌等益生菌能代替抗生素应用于水产养殖防控病害。

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