MnMats，MnTaiman及一种高变C-型凝集素在日本沼虾先天免疫中的功能研究

发布时间：2020-09-09 18:15

　　日本沼虾(Macrobrachium nipponense)俗称河虾或青虾,是一种重要的淡水养殖虾类。其适应能力强,食性杂,繁殖力强,广泛分布于我国大小水域,是我国重要的养殖虾类之一。河虾肉质鲜美,营养丰富,在我国水产品市场广受欢迎。但随着现代工业化进程的迅速发展,各地水域水质均受到不同程度破坏,加上养殖业自身发展的不健康和不规范,进一步加剧了养殖水域水环境的恶化,导致包括河虾在内的咸淡水经济虾类养殖受多种疾病困扰,而研究河虾先天免疫防御机制,可以对生产实践中的疾病防控进行有效指导。模式识别受体和免疫信号途径作为无脊椎动物先天免疫系统的重要组成部分,在无脊椎动物对抗病原微生物感染过程发挥重要作用。本论文首先对日本沼虾Hippo信号通路中Mats基因进行了研究。Yorkie是Hippo信号通路的转录因子,促进Cactus基因(Toll信号通路)的表达。而Yorkie作为转录因子,行使功能时,需要与其它蛋白进行互作,Taiman是Yokie的一种互作蛋白,在该论文中,我们对Taiman基因的选择性剪切以及在免疫防御中的功能进行了初步研究。最后,我们对发现的一种高变C-型凝集素(在编码区,通过含有不同数目的重复单元,增加凝集素多样性)的功能进行了初步研究。1.MnMats基因在日本沼虾先天免疫中的功能在本研究中,我们发现并命名了MnMats基因,获得了其cDNA序列,cDNA全长为1127bp,开放阅读框(ORF)大小为651bp,编码217个氨基酸长度的蛋白,含有一个Mob1_phocein结构域。我们研究了其在日本沼虾中的组织分布情况,发现其在各个组织中均有分布,肝胰腺中表达量最大,而血细胞中最低。我们进一步研究了其在金黄色葡萄球菌/副溶血弧菌刺激时的表达模式,发现金黄色葡萄球菌刺激时,除血细胞和胃以外,各个组织MnMats均呈上调趋势。而当机体面对副溶血弧菌刺激时,除胃以外其他组织中MnMats也均上调。RNAi敲低MnMats后,发现多种抗菌肽表达受到了抑制。这些研究结果表明,作为Hippo信号通路中的重要组件,MnMats基因可能通过抑制Cactus基因的表达,促进抗菌肽的表达,从而参与了日本沼虾先天免疫防御。2.MnTaiman基因在日本沼虾先天免疫中的功能我们在日本沼虾中发现并命名了MnTaiman基因。日本沼虾Taiman基因存在四种不同的转录本。其中最长的转录本cDNA全长为6894 bp,开放阅读框(ORF)全长为4998 bp,编码长度为1666个氨基酸的蛋白。含有一个PAS结构域、一个HLH结构域和一个PAS_11结构域。半定量进行组织分布研究时,发现MnTaiman基因C末端存在选择性剪切,产生四种不同的剪切本,命名为TaiA、TaiB、TaiC、TaiD。qRT-PCR结果表明,MnTai-Total(TaiT)、TaiA、TaiB、及TaiD的组织分布相似,在各个组织中均有分布,并且在肝胰腺中高表达。但TaiC在胃组织中高表达。金黄色葡萄球菌/副溶血弧菌刺激下的表达模式实验,结果表明,除血细胞之外,在其他组织中TaiT及四种转录本呈现不同的表达模式。在血细胞中,病原刺激后基因均呈下调趋势。在河虾血细胞中,RNA干扰敲低MnTaiman,金葡萄球菌刺激后24h,ALF1表达显著增高。MnTaiman敲低后,副溶血弧菌刺激后24h,ALF1表达也明显上调。根据已有文献,Taiman和Yorkie互作,而Yorkie调节Cactus的表达。所以我们推测,MnTaiman通过调控Cactus的表达,负调控Toll信号通路,从而抑制抗菌肽基因的表达。3.一种高变C-型凝集素功能研究我们在日本沼虾中发现一种C-型凝集素,由于其编码区含有不同数目的重复单元,因此,我们命名为repeat lectin-MnRlec。该蛋白含有一个信号肽、一个CLECT结构域,在这两个结构域之间包含一个含有不同数目重复单元的区域,该区域含有的串联重复可以高达9个,最少含有一个串联重复。在基因组上,我们也发现了含有不同数目重复单元的序列,因此我们推测,含有不同数目重复单元的凝集素,在基因组复制过程中,发生了滑动错配,导致基因多样性的产生。我们表达和纯化了三种分别含有1个、2个、3个串联重复单元的MnRlec蛋白,命名为MnRlec1、MnRlec2、MnRlec3。对这三种蛋白进行细菌结合实验,结果发现MnRlec1对副溶血弧菌的结合呈现出钙离子依赖的特征,MnRlec2和MnRlec3对副溶血弧菌的结合能力减弱。此外,MnRlec1、MnRlec2以及MnRlec3均表现出对大肠杆菌的结合能力,且这种结合不依赖于钙离子。通过我们的研究发现,MnRlec随着重复单元的增加,结合副溶血弧菌的能力减弱,这可能是病原和宿主在进化过程中进行博弈的结果。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

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设计特异引物，以日本沼虾的各个组织 cDNA（血、心、为模板，使用常规 PCR 扩增获得的四种剪切本的电泳图。ith gene-specific primers, we gain the four different splicing trTaiA-TaiD) using RT-PCR methods. The cDNA from hemocyts, gills, stomach and intestine of M. nipponense were used as an 的四种剪切体（TaiA、TaiB 、TaiC 和 TaiD）模式图。五个外显子的长度。

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图 3.2. 通过设计特异引物，以日本沼虾的各个组织 cDNA（血、心、肝、鳃、胃和肠）为模板，使用常规 PCR 扩增获得的四种剪切本的电泳图。Fig.3.2. With gene-specific primers, we gain the four different splicing transcripts ofMnTaiman (TaiA-TaiD) using RT-PCR methods. The cDNA from hemocytes, heart,hepatopancreas, gills, stomach and intestine of M. nipponense were used as templates.

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atgattgatcaggagatatataaataaaatttgactcagttaaattacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa图.4.1. （A）日本沼虾 MnRlec 的 cDNA 序列和预测的氨基酸序列。图中灰色阴影部分为 CLEC 结构域，划线部分为信号肽（Signal peptide），彩色阴影表示 6 个短串联重复单元

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