MAPK在雌核发育二倍体鲫鲤性腺发育中的表达分析

发布时间：2020-09-11 23:55

　　丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)信号途径在真核细胞基因表达、细胞增殖、分化、凋亡、新陈代谢等生理病理过程中发挥着重要的作用。通过远缘杂交、雌核发育操作技术已经成功研制出不同倍性经济鱼类,其中雌核发育二倍体鲫鲤具有产生二倍体卵子的现象。不减数配子的形成可能与生殖细胞的核内复制或生殖细胞的细胞融合有关。本实验以雌核发育二倍体鲫鲤为材料,研究MAPK家族的主要成员ERK和JNK在雌核发育二倍体鲫鲤性腺中的表达分析,为进一步解析雌核发育二倍体鲫鲤不减数配子发生中的分子调控机制奠定基础。具体研究内容如下:(1)根据已知物种斑马鱼erk1基因的cDNA序列,克隆了红鲫、三倍体湘云鲫、异源四倍体鲫鲤和雌核发育二倍体鲫鲤中erk1基因的编码区中间片段序列,测序得到709bp的中间段序列,其中雌核发育二倍体鲫鲤与二倍体红鲫、三倍体湘云鲫,异源四倍体鲫鲤和斑马鱼erk1基因编码区中间片段的相似性分别为99.7%、99.7%、96.3%、91.9%。(2)运用Western-blot技术检测JNK、p-JNK、ERK在雌核发育二倍体鲫鲤和不同倍性鱼性腺组织中表达分析。结果显示,JNK、ERK在鱼类性腺组织中均有较高量的表达,但在鱼类卵巢和精巢间、雌核发育二倍体鲫鲤和不同倍性鱼的性腺组织间,JNK或ERK的表达量并不存在明显的差异。值得关注的是,P-JNK在雌核发育二倍体鲫鲤性腺中的表达量远高于三倍体和四倍体鲫鲤的卵巢组织。(3)对雌核发育二倍体鲫鲤早期性腺的组织学观察表明,6~10月龄雌核发育二倍体鲫鲤的性腺处于I期卵巢发育阶段。8~10月龄的雌核发育二倍体鲫鲤的性腺中均可观察到性原细胞旺盛的分裂。运用Western-blot技术检测JNK、ERK在雌核发育二倍体鲫鲤早期性腺发育的表达。结果显示10月龄雌核发育二倍体鲫鲤性腺中JNK表达水平较6、8月龄的要高。ERK在6、8、10月龄的雌核发育二倍体鲫鲤性腺的表达成下调趋势。(4)采用免疫组织化学检测了ERK和JNK在雌核发育二倍体鲫鲤早期性腺组织中的表达。结果显示JNK和ERK在雌核发育二倍体鲫鲤早期性腺中有阳性表达。其中JNK在10月龄雌核发育二倍体鲫鲤性腺中的阳性反应强度高于6、8月龄。而ERK在8月龄和10月龄的性腺中的阳性反应则弱于6月龄。这与Western-blot技术检测结果相一致。综上所述,本研究探讨了MAPK信号传导通路,尤其是JNK、ERK在雌核发育二倍体鲫鲤性腺中的功能,结果表明MAPK通路可能对雌核发育二倍体鲫鲤产生不减数配子具有重要调控作用。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

序列,三倍体湘云鲫,异源四倍体鲫鲤,红鲫

第三章实验结果与分析3.1 红鲫、三倍体湘云鲫、异源四倍体鲫鲤以及雌核发育二倍体鲫鲤 erk1 基因的克隆及序列分析分别提取二倍体红鲫、三倍体湘云鲫、异源四倍体鲫鲤以及雌核发育二倍体鲫鲤的性腺组织的总 RNA。根据已知物种斑马鱼（NM_201507.1）中 erk1 基因的 cDNA 序列，设计的引物，通过 PCR扩增获得了 700bp 左右的 DNA 条带（图 3-1）。测序结果得到 709bp的中间段序列。

碱基序列,三倍体湘云鲫,二倍体,中间片

26图 3-2 erk1 基因碱基序列比对与保守性发育二倍体鲫鲤（2G）与二倍体红鲫（2N）、三倍体湘云鲫（3N）、异源四、斑马鱼 erk1 基因编码区中间片段碱基序列比对；图 B 为雌核发育二倍体倍体红鲫（2N）、三倍体湘云鲫（3N）、异源四倍体鲫鲤（4N）、斑马鱼中间片段在进化上的保守性分析。

雌核发育,二倍体,倍性,父母本

28图 3-3 MAPK 在雌核发育二倍体鲫鲤和不同倍性鲫鲤及其原始父母本性腺中表达图 A.B.C 分别 JNK、P-JNK、ERK 在雌核发育二倍体鲫鲤和不同倍性鱼类的性腺组织中的蛋白水平表达；图 D、E、F 分别为 A、B、C 的灰度分析结果图。图 3-4 雌核发育二倍体鲫鲤早期性腺的 HE 染色的组织学观察图 A 为 6 月龄的雌核发育二倍体鲫鲤性腺组织学切片；图 B 为 8 月龄的雌核发育二倍体鲫鲤性腺组织学切片；图 C 为 10 月龄的雌核发育二倍体鲫鲤性腺组织学切片。比例尺：100um

【参考文献】