牙鲆kiss2及其受体gpr54-2基因的分子鉴定及表达分析

发布时间：2020-09-12 19:32

　　牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种重要的海水养殖经济鱼类,雌性个体的生长速度明显快于雄性个体,因而关于牙鲆性别分化及生殖调控的研究成为目前研究的热点。Kisspeptin/Gpr54系统的发现及其鉴定是神经内分泌学的一项重大突破,也是脊椎动物生殖研究领域的一场新革命。目前关于Kisspeptin系统的研究主要集中在哺乳类动物,在鱼类中的研究仅仅处于起步阶段,而在牙鲆中仍未见报道。因此,本研究克隆了牙鲆kiss2及其受体gpr54-2基因,检测了二者在牙鲆早期发育阶段及成体各组织的表达情况;运用western-blot和免疫组化方法检测了Gpr54-2蛋白在牙鲆脑、性腺和肝脏组织中的表达情况,以期为进一步阐明kiss2基因在牙鲆生殖中的作用提供基础。其主要结果如下:1牙鲆kiss2及其受体gpr54-2基因的分子鉴定从牙鲆脑组织中克隆得到牙鲆kiss2及其受体gpr54-2基因c DNA序列。其中获得的牙鲆kiss2c DNA长度为449 bp,该序列包括一段83 bp的3'非翻译区和一段编码121个氨基酸残基的366 bp开放阅读框;牙鲆gpr54-2 c DNA全长为2556bp,该序列包括1143bp的开放阅读框,899bp的5'非翻译区(UTR)及504bp的3'非翻译区,编码380个氨基酸。系统进化树分析结果表明,牙鲆Kisspeptin与脊椎动物Kisspeptin-2聚为一支;牙鲆Gpr54-2鱼类Gpr54-2聚为一支。氨基酸相似性分析表明,牙鲆Kisspeptin2与条纹鲈(Morone saxatilis)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、塞内加尔鳎(Solea senegalensis)及斑马鱼(Danio rerio)Kisspeptin2的同源性分别为76%、74%、69%和28%。牙鲆Gpr54-2与大西洋庸鲽(Hippoglossus hippoglossus)、塞内加尔鳎(Solea senegalensis)及斑马鱼(Danio rerio)的Gpr54-2的同源性分别为98%、93%和88%。2 kiss2及gpr54-2在牙鲆成体各组织的表达分布采用实时荧光定量PCR检测了kiss2及其受体gpr54-2基因在牙鲆成体各组织的表达分布情况。其中牙鲆kiss2基因在脑中的表达量最高,在肝、鳃、肠和卵巢中次之,在肌肉、精巢和心脏中的表达量较低,而在胃和肾中没有检测到kiss2基因的表达。而gpr54-2基因在所检测的牙鲆组织包括脑、肌肉、心脏、鳃、肾、胃、肝脏、肠、性腺中都有表达,但表达量差异很大。其中gpr54-2在牙鲆脑组织中的表达量最高,其次是性腺组织,且在卵巢的表达量稍高于精巢,而在其它组织中的表达量则相对较低。kiss2及其受体gpr54-2在牙鲆脑中的丰富表达及在精卵巢中的较高表达表明二者很有可能与牙鲆神经系统和生殖发育相关。3 kiss2及gpr54-2在牙鲆早期不同发育阶段的表达图式实时荧光定量结果显示,在牙鲆未受精卵没有检测到kiss2的表达,且在胚胎发育期间均保持较低的表达水平。而在孵化后仔鱼中kiss2基因的表达量明显升高,至孵化后第29天(29 dph)达到高峰。gpr54-2基因在牙鲆胚胎及仔鱼阶段都有表达,在胚胎发育早期其表达量相对较低,而在孵化后仔鱼中表达量升高。至孵化后第36天(36 dph)达到高峰。这些结果表明kiss2及其受体gpr54-2基因在牙鲆早期发育阶段的表达趋势基本一致。4 Gpr54-2蛋白在牙鲆成体组织中的表达情况采用多肽亲和法制备了牙鲆Gpr54-2蛋白多克隆抗体。应用该抗体,Western-blot结果显示,Gpr54-2蛋白在牙鲆脑、精巢和卵巢中均有明显的表达,而在牙鲆肝组织中仅有较弱的表达。但应用该抗体的免疫组化结果显示各组织信号不明显,表明该抗体可能不适用于免疫组化实验。本研究结果为后续深入探讨kiss2及其受体gpr54-2基因在牙鲆性别分化及生殖的作用打下了基础。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

氨基酸序列,牙鲆,基因序列,氨基酸序列

子量为 13.7 KD。通过 BioEdit 软件分析，在其第五和第十五个氨基酸之间有一个典型的疏水性区域。图2-1 牙鲆kiss2基因序列及其推导的氨基酸序列＿表示信号肽；*表示终止密码子；□表示加尾信号和Kisspeptin-10序列；◇表示蛋白水解切割位点Fig.2-1 Nucleotide and deduced amino acids sequences of P. olivaceus kiss2The putative signal peptide is underlined. The stop codon (TGA) is shown by asterisks (*). Thepolyadenylation signal (AATAAA) and putative Kisspeptin-10 region (FNYNPLTLRF) are boxed. Theproteolytic cleavage site (GKR) is marked as diamond.通过氨基酸比对发现，牙鲆 kiss2 与条纹鲈（Morone saxatilis）的同源性最高，为 76%，接着是欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax），为 74%；与带点石斑鱼（Epinephelus coioides）、（罗非鱼（Oreochromis niloticus）和塞内加尔鳎（Soleasenegalensis）的同源性依次为 72%、70%和 69%。而其与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、斑马鱼（Danio rerio）、鲫鱼（Casrassius auratus）的同源性较低，依次为为 34%、28%和 25%，与巴西乌龟（Trachemys scripta elegans）和非洲爪蟾（Xenopus siluranatropicalis）的同源性也仅为 24%。然而，Kisspeptin-10 片段区域在脊椎动物中高度

氨基酸序列,牙鲆,比对分析,氨基酸序列

图 2-2 牙鲆 kiss2 氨基酸序列比对分析颜色不同表示保守性不同；Kisspeptin-10区域用红色的方框标示。Fig.2-2 Alignment of amino acid sequences of P. olivaceus kiss2 and other species kiss2The identical, highly and less conserved amino acid residues are indicated by different colors,respectively. The Kisspeptin-10 regions are shown in boxes (color red).系统进化树分析结果显示，脊椎动物 Kisspeptins 分为两支，即 Kisspeptin-1 和Kisspeptin-2。牙鲆 Kisspeptin 与脊椎动物 Kisspeptin-2 聚为一支（图 2-3）。

系统进化树,氨基酸序列,牙鲆,序列

23图 2-3 kiss1和kiss2氨基酸序列构建的系统进化树Fig.2-3 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequences of vertebrate kiskiss2 genes..3 牙鲆 gpr54-2 基因的克隆以牙鲆脑组织 RNA 为模板，首先进行 gpr54-2 部分 cDNA 片段的 PCR 到长度分别为 638bp、234bp 和 138bp 的 EST 序列；通过 3'-RACE PCR 得 793 bp 的序列，通过 5'-RACE PCR 得到长度为 1114bp 的序列。经过拼接长度为 2556bp 的牙鲆 gpr54-2 cDNA 全长序列（图 2-4）。该序列包括 1143放阅读框，899bp 的 5'非翻译区（UTR）及 504bp 的 3'非翻译区，编码 380酸。其蛋白具有 7 个跨膜区域。经预测其氨基酸理论等电点为 9.01，分子0KD。

【共引文献】