淡水贝类i型和噬菌体型溶菌酶基因克隆与表达

发布时间：2020-09-15 20:24

　　 本实验采用巢氏PCR方法和RACE PCR技术分别克隆得到褶纹冠蚌i型溶菌酶基因(CpLYZ3)的cDNA序列,三角帆蚌噬菌体型溶菌酶基因(HcPLYZ)的cDNA序列。克隆得到的CpLYZ3 cDNA长为968bp,其中5'非编码区(UTR)为395bp,开放阅读框(ORF)含有432bp,3'非编码区(UTR)为141bp,编码143个氨基酸残基,推导的蛋白分子量为15.6KD,等电点为6.09,通过分析发现重组蛋白含有由17个氨基酸组成的信号肽。从多序列同源性比对发现,该基因具有i型溶菌酶基因中的一些保守功能位点:Glu61和Asp72,并且与其它的i型溶菌酶基因序列同源性较高27-87%,初步断定该序列属于i型溶菌酶基因。通过对CpLYZ3基因在褶纹冠蚌不同组织中的表达情况分析发现:CpLYZ3的mRNA表达在血淋巴、肝胰腺、外套膜、肌肉和鳃组织中存在差异。CpLYZ3在肝胰腺中的表达量是最高的,其次是在外套膜和鳃中,而在肌肉中表达量最低。分别用嗜水气单胞菌和肽聚糖刺激后,在血淋巴、肝胰腺和鳃组织中表达量均升高,在肝胰腺中表达量变化最明显,分别是空白对照的32倍和14.2倍。说明该溶菌酶主要在褶纹冠蚌肝胰腺中起作用。将褶纹冠蚌CpLYZ3序列与表达载体PET-30a(带有组氨酸标签)连接,成功构建了 PET-30a-LYZ3原核表达质粒。将该质粒转化到大肠杆菌BL21菌株后,诱导得到大量融合蛋白。经分析确认所获得的重组蛋白在21KD左右,与预测蛋白大小一致。HcPLYZ基因序列全长为829bp,其中5'UTR(非编码区)长度为97 bp;开放阅读框(ORF)长度为468bp;3'UTR长度为264bp,编码154个氨基酸。经分析发现,该蛋白N端没有信号肽。推导的蛋白分子量为17.6KD,等电点为5.89。推导的HcPLYZ氨基酸序列中包含2个高度保守的噬菌体型溶菌酶活性位点(Glu20和Asp29)。将三角帆蚌血淋巴、肝胰腺、鳃和外套膜这四个组织上洗脱下来的微生物涂平板,然后挑取菌落进行PCR,发现这些微生物中也存在HcPLYZ基因,因此初步推测HcPLYZ是从三角帆蚌体内共生菌中克隆得到。通过对HcPLYZ基因在三角帆蚌不同组织中的表达分析发现,在血淋巴、肝胰腺、外套膜、肌肉和鳃组织中均有表达。用嗜水气单胞菌刺激后,在血淋巴、肝胰腺和鳃组织中表达量均升高,在鳃中表达量变化最明显。说明该溶菌酶在三角帆蚌免疫反应中起到重要的作用。将三角帆蚌HcPLYZ序列与表达载体PET-30a(带有组氨酸标签)连接,成功构建了 PET-30a-LYZ3原核表达质粒。将该质粒转化到大肠杆菌BL21菌株后,诱导并成功表达出重组蛋白。通过Ni2+螯和层析法获得了纯化的蛋白。另外,以溶壁微球菌为底物,检测到重组HcPLYZ的最适pH为5.5,最适温度为50℃。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S944.1
【部分图文】：

图１＿１机体的非特异性免疫系统的组成逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ｓｙｓｔｅｍ．逡逑２逡逑

和Ｎ－乙酰氨基葡萄糖（ＮＡＧ）之间的Ｐ－１，４糖苷键，通过水解糖苷键，使糖从逡逑不溶性变成可溶性，在细胞内渗透压的作用下使得细菌裂解＞２２］。然而，革兰氏逡逑阴性菌表面有一层脂多糖（如图１－２所示），所以溶菌酶对其并不能直接作用［２３］。逡逑但对于这层障碍来说，机体能通过非特异性免疫的其它成分（如防御素和乳铁逡逑蛋白等）“松动”外膜，然后进入使其糖链裂解。逡逑而对于噬菌体型溶菌酶来说，初期的研宄也认为其能高效的破坏细菌细胞逡逑壁上肽聚糖中的Ｐ－１．４糖苷键引起细菌细胞死亡［２４］。通过对噬菌体型溶菌酶三维逡逑结构的分析，发现其蛋白在Ｃ端含有４个ａ螺旋结构域（ａｌ，0２，0３和ａ４），逡逑其中ａ４是典型的双亲性螺旋机构，它带的正电荷在与带负电荷的抑菌细胞膜进逡逑行相互识别和作用过程中起到重要的作用，从而干扰了细菌细胞正常的生理代逡逑谢，杀死细菌［２５］。逡逑对革兰氏阳性和阴性菌来说

图２－１邋ＳＭＡＲＴ技术原理图（引自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ技术手册）。逡逑注：ＣＤＳ引物、Ｓｍａｒｔ邋ＩＩ寡核苷酸、ＰＣＲ引物都有一段相同的序列．邋２－１邋Ｔｈｅｏｒｙ邋ｃｈａｒｔ邋ｏｆ邋ＳＭＡＲＴ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋（ｆｒｏｍ邋Ｃｌｏｎｔｅｃｈ邋ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｍａｎｕａｈｅ邋ＣＤＳ，邋Ｓｍａｒｔ邋ＩＩ邋ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ａｎｄ邋ＰＣＲ邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｃｏｎｔａｉｎｅｄ邋ａ邋ｓｔｒｅｔｃｈ邋ｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅ．逡逑

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本文编号：2819423