中华鲟血液雌二醇和睾酮检测方法的建立及应用

发布时间：2020-09-15 18:00

　　由于长江生态环境的恶化,中华鲟(Acipenser sinensis)关键栖息地面积逐渐缩小,适合度降低,自然繁殖由连续变为偶发,自然种群资源被破坏后难以短期内自主恢复,野生资源濒临灭绝。全人工繁殖的成功,使保存种质资源和恢复野外种群成为可能。然而,中华鲟第二性征不明显,生殖状态难以准确判断,且人工繁殖过程中出现催产成功率低,受精率低等问题,严重影响人工繁殖效果。血液性类固醇激素,如睾酮(Testosterone)和雌二醇(Estradiol)与鱼类性腺发育具有显著相关性,能够反映多种鱼类的生殖状况,准确判定鱼类性别和性腺发育期。因此有必要利用血液睾酮和雌二醇水平连续监测中华鲟生殖状态,有效筛选养殖环境下的性成熟个体。以中华鲟全血为检测对象,雌二醇和睾酮为检测目标。前处理过程采用乙腈提取,N-丙基乙二胺(Primary secondary amine,PSA)净化,检测过程采用高效液相色谱-荧光法(High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence,HPLC-FLD)检测血液雌二醇,高效液相色谱-质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)检测血液睾酮。结果表明,雌二醇在0.5~50 ng/mL的范围内标准曲线为y=0.528x-0.1325,相关性良好(R~2=0.999),检测限0.40 ng/mL;睾酮在0.1~5.0 ng/mL的范围内标准曲线为y=0.4978x+0.0339,R~2=0.999,检测限0.05 ng/mL。两种回收率均在80%~120%,出峰时间基本一致,精密度良好,相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)均小于2%。该方法采用全血,节约样品,并可满足中华鲟成体血液雌二醇和睾酮水平的检测。以9~17龄养殖中华鲟为对象,利用B超仪采集性腺发育图像,通过提取鳍条基因组DNA,扩增性别特异性条带,采用高效液相色谱及其质谱联用法检测血液雌二醇和睾酮水平。得到以下结果:9~17龄养殖中华鲟性腺发育大部分(77.66%)处于Ⅱ期,Ⅲ期、Ⅳ期约占22.34%;雌性中华鲟基因组DNA出现特异性条带;养殖中华鲟性腺最早9龄时向Ⅲ期发育,同一年龄不同性别的中华鲟,其性腺发育期不完全一致;雌鲟血液雌二醇、睾酮水平变化基本一致,不同年龄段睾酮平均水平较低,雌二醇水平高于睾酮,最高超过7.000 ng/mL;雄鲟血液睾酮水平变化趋势明显,最低的浓度小于2.000 ng/mL,最高浓度接近8.000 ng/mL,雌二醇维持在较低水平(低于1.000 ng/mL)且基本不变。对养殖中华鲟繁殖周期,及特定年龄的发育期,暂无法定论,需要根据大量样品,结合多种判定方法,进一步总结规律,准确判断其发育期,通过养殖经验等进一步验证。以中华鲟和长江鲟(Acipenser dabryanus)尿液为检测对象,应用高效液相色谱-荧光法检测L-色氨酸。尿液样品经甲醇、乙腈提取,ENVI-18固相萃取小柱净化,在荧光波长λ_(ex)=285 nm,λ_(em)=353 nm等色谱条件,得到L-色氨酸标准品的峰面积与其质量浓度关系,检出限(LOD)为0.005μg/mL,定量限(LOQ)为0.020μg/mL,L-色氨酸加标回收率在80%~120%。检测结果表明,这种首次建立的检测长江鲟科鱼类芳香族氨基酸的方法可靠,能够应用于鱼类生物基质具有苯环结构的物质的检测。本研究建立的高效液相色谱及其质谱联用法可有效检测中华鲟血液雌二醇和睾酮,高效液相色谱荧光法能够检测鲟鱼尿液L-色氨酸,将为进一步掌握养殖中华鲟性腺发育规律提供检测方法,从而有效筛选性成熟亲鱼。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S931
【部分图文】：

色谱图,雌二醇,血液,标准品

结果见表 2-4。峰面积相对标准偏差（RSD）为 0.04%～平均值（6.011±0.025）min，相对标准偏差（RSD）为 0.42%。加标回收率实验每个水平平行测 5 次，回收率结果见表 2-2。107.8%，相对标准偏差（RSD）为 5.32%～8.73%。鲟血液雌二醇和睾酮检测结果鲟血液雌二醇检测结果见图 2-1，a 为雌二醇标准品 1、2、5、，b 为其中一尾中华鲟全血液相检测色谱图。图 2-1 中 a 结果显的雌二醇标准品出峰时间一致，峰面积以一定关系增加，样品峰，出峰时间相差不足 0.1 s，且 1 min 内无杂峰出现，表明中定浓度的雌二醇。鲟血液睾酮检测结果见图 2-2，左边是睾酮标样（0.5 ng/mL）液边是中华鲟血液检测出峰图，四个峰从上到下依次是母离子（97.200），子离子（109.100）和内标（甲基睾酮-D3）。标样和华鲟血液中有一定水平的睾酮。

睾酮,液质,血液,出峰

图 2-2 睾酮标准品（0.5 ng/mL）和中华鲟血液目标物液质出峰图Fig.2-2 Liquid chromatography mass spectrometry of Testosterone standard (0.5 ng/mL) and Asinensis blood target.5 讨论.5.1 样品前处理方法的优化样品前处理过程的提取步骤选取了甲醇、乙腈和乙酸乙酯三种常用有机试剂化步骤，选择了 HLB 固相萃取柱、C18 固相萃取柱[54]以及吸附剂 PSA，并考九种组合的处理效果。结果表明，乙腈提取，PSA 净化组合，前处理效果比。血液是一种比较复杂的基质，若将其简单化，分为有机成分和无机成分。实验影响较大的是有机物中含量较高的蛋白质、脂质等大分子物质。因此，选择三种去除蛋白质、脂质的常用试剂，其极性分别为甲醇 6.6，乙腈 6.2，乙酯 4.3。雌二醇和睾酮的极性更接近于乙腈的极性，根据相似相溶原理，目更易与乙腈互溶，粉末状PSA与HLB固相萃取柱均为正向萃取，吸附极性杂质

中华鲟,性腺发育

图 3-2 9～15，17 龄中华鲟性腺发育期Fig.3-2 9-15, 17-year-old A. sinensis gonad development别鉴定结果验鉴定了 9～15，17 龄中华鲟性别，结果显示，本实验中雄性 45 尾性别特异基因仅存在于雌性中华鲟，因此，电泳结果为条带单一的的雄性，如图 3-3，DNA Marker 左侧是有特异性条带的是雌性，右带的是雄性。根据电泳结果，统计出每个年龄组的性别比例，如图组雌雄比例在 0.38～3.5 之间，所有个体雌雄比例 38：45，比例大于图 3-3 中华鲟性别鉴定结果Fig.3-3 Results of A. sinensis gender identification90100）

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