墨西哥湾扇贝转录组分析及其与扇贝“渤海红”杂交F1代分子标记研究
发布时间：2020-09-15 14:59
墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)是中国南方海域养殖的重要经济双壳贝,1991年引进至今,经历了20多年小群体繁育养殖,种质退化严重。引进新的遗传资源,取得墨西哥湾扇贝种质遗传改良研究的突破性进展是实现其养殖业健康可持续发展的根本。扇贝“渤海红”为中国北方海域重点推广养殖的新品种,课题组已于2015年9月从山东引进扇贝“渤海红”,并与本课题组选育的“墨西哥湾扇贝大闭壳肌新品系”进行了杂交,小试获得成功,其杂交可行性和形态杂种优势均已被证实,但相关分子遗传学基础还比较薄弱。因此,本研究围绕墨西哥湾扇贝及其与扇贝“渤海红”杂交F1代的分子遗传学鉴定和评估,开展了以下研究:1、墨西哥湾扇贝转录组Illumina测序及生物信息学分析基于Illumina Hi Seq~(TM)2000平台,对2组生长速率不同的5月龄墨西哥湾扇(普通养殖群体)进行RNA-seq测序,获得109 911条高质量Unigenes,平均长度为1452 bp,其中50 433条(45.89%)Unigenes获得注释。根据FDR≤0.001且|log2Ratio|≥1的原则,筛选出9 901个差异表达基因,随机选择9个差异基因进行q RT-PCR验证,结果显示,q PCR基因表达的整体趋势与RNA-Seq测序结果呈线性相关(R2=0.9193),初步说明转录组测序对于基因表达趋势的预测是准确的。对差异表达基因进行KEGG代谢通路及GO功能富集分析,筛选到了TGF-β、MAPK信号转导等几个参与细胞增殖和分化的重要通路;差异基因在GO分类中的覆盖面较广,说明墨西哥湾扇贝的生长是生物学过程的全方位响应。研究结果为墨西哥湾扇贝生长相关基因挖掘、生长发育机制揭示及分子标记开发等提供了理论支撑。2、基于转录组测序的墨西哥湾扇贝生长相关基因及SNPs筛选生长相关基因是指在细胞分化及成熟或组织生长及重构方面起促进或抑制作用的一类基因。本研究基于Blast比对、GO和KEGG多种数据库注释,从墨西哥湾扇贝比较转录组差异表达基因中筛选出38个生长相关基因,涉及肌肉生长蛋白、消化酶和生长因子及其受体等18个类别。通过PCR扩增直接测序法对墨西哥湾扇贝转录组Unigene23250和CL4903.Contig2序列上预测到的潜在SNP位点进行验证,共检测到5个中度多态SNPs(0.25PIC0.50),包含4个转换和1个颠换。CL4903.Contig2序列上的3个完全连锁位点(A-6167-T、G-6178-A、G-6185-A)与Unigene23250序列上的G-1142-A位点发生非同义突变。对已鉴定的SNP与体质量、闭壳肌重、壳长、壳宽和壳高的相关性进行单因素方差分析,结果显示,Unigene23250 G-1142-A位点AA基因型在体质量、闭壳肌重及壳长、壳宽和壳高上的均值都显著高于AG和GG基因型(P0.05),但AG和CG基因型在这5个性状上的差异不显著(P0.05)。CL4903.Contig2的G-6085-A位点AA基因型的体质量及闭壳肌重均值显著高于AG和GG基因型(P0.05),但这两个位点不同基因型间形态性状差异不显著(P0.05)。推断AA为优势基因型。研究结果表明,基于墨西哥湾扇贝转录组筛选到的这几个SNP位点具有用于生长性状分子辅助选育的潜力。3、墨西哥湾扇贝与扇贝“渤海红”SSR开发及其杂交F1代验证为对墨西哥湾扇贝与扇贝“渤海红”杂交F1代进行分子遗传学鉴定和评估,本研究以墨西哥湾扇贝普通养殖群体40个个体对其转录组查找到的117个潜在SSR进行筛选。结果有26个为多态位点(22.2%),其中21个(80.77%)在扇贝“渤海红”中通用;多态位点主要为二碱基、6重复,扩增效率最高的是AT。随机选择8个多态SSR对扇贝“渤海红”和墨西哥湾扇贝两群体的遗传多样性进行评估。结果显示,墨西哥湾扇贝群体的遗传多样性低于扇贝“渤海红”群体,两个群体的遗传距离为0.348,两者杂交能产生杂种优势。开发3个扇贝“渤海红”与墨西哥湾扇贝特异SSR,利用这3个特异SSR对40个扇贝“渤海红”和墨西哥湾扇贝杂交F1代个体进行验证,3个特异SSR在F1代中的扩增片段均不重叠,且同时存在来自墨西哥湾扇贝和扇贝“渤海红”的特异等位基因,也未出现非亲本之外的条带,证明这些子代均为墨西哥湾扇贝和扇贝“渤海红”的杂交子代。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
图 2-1 RNA 提取步骤Fig.2-1 The procedure RNA extraction构建、Illumina 测序和 De novo 组装格后，2 组样品各取 1 μg 用于转录组文库构建。具体方re Beads富集真核生物mRNA，采用高温和金属离子作用mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合A 为模板合成二链 cDNA[78]，再用 VAHTSTM DNAC(3)纯化的双链 cDNA 先进行末端修复及加 A 尾操作，然TSTMDNA Clean Beads 进行片段大小分选[79]；(4)最后STM DNA Clean Beads 纯化 PCR 产物，得到最终的文gilent 2100 Bioanalyzer 进行质检。格后在 Illumina HiSeq 2000 平台上进行 6G 数据量测的原始数据(Raw reads)，删除接头和低质量 Reads， Trinity 软件对高质量 Clean reads 进行 De novo 组装[8gicl将其去冗余和进一步拼接、同源转录本聚类，得到最
图 2-2 De novo 组装流程Fig.2-2 The process of De novo assemblynigene 功能注释组装得到的 Unigene 在六大数据库进行比对注释，并分别对注释到每个注释上的 Unigene 数目进行统计。六大数据库分别为：非冗余蛋白序列、非冗余核酸序列数据库 (Nt)、高质量非冗余的蛋白数据库 (Swiss-P理基因组、生物通路、疾病、药物和化学物质之间联系的集成数据库(K源家族蛋白数据库(COG)和 GO 数据库。差异表达基因筛选过 FPKM 计算法[82]对 Unigene 表达量进行标准化，然后使用 DEGseq 软样本间相同基因的表达量进行差异分析，并以 FDR(false discovery rate2Fold≥1(快速生长组/慢速生长组)为阈值，筛选差异表达基因(Differesed unigene)。FPKM[82]是目前计算基因表达量最常用的方法，其是指每中来自某一基因每千碱基长度的 Fragment 数目。其计算公式为： =106 3公式 (2-1)
LabchipGX检测胶图
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
图 2-1 RNA 提取步骤Fig.2-1 The procedure RNA extraction构建、Illumina 测序和 De novo 组装格后，2 组样品各取 1 μg 用于转录组文库构建。具体方re Beads富集真核生物mRNA，采用高温和金属离子作用mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合A 为模板合成二链 cDNA[78]，再用 VAHTSTM DNAC(3)纯化的双链 cDNA 先进行末端修复及加 A 尾操作，然TSTMDNA Clean Beads 进行片段大小分选[79]；(4)最后STM DNA Clean Beads 纯化 PCR 产物，得到最终的文gilent 2100 Bioanalyzer 进行质检。格后在 Illumina HiSeq 2000 平台上进行 6G 数据量测的原始数据(Raw reads)，删除接头和低质量 Reads， Trinity 软件对高质量 Clean reads 进行 De novo 组装[8gicl将其去冗余和进一步拼接、同源转录本聚类，得到最
图 2-2 De novo 组装流程Fig.2-2 The process of De novo assemblynigene 功能注释组装得到的 Unigene 在六大数据库进行比对注释，并分别对注释到每个注释上的 Unigene 数目进行统计。六大数据库分别为：非冗余蛋白序列、非冗余核酸序列数据库 (Nt)、高质量非冗余的蛋白数据库 (Swiss-P理基因组、生物通路、疾病、药物和化学物质之间联系的集成数据库(K源家族蛋白数据库(COG)和 GO 数据库。差异表达基因筛选过 FPKM 计算法[82]对 Unigene 表达量进行标准化，然后使用 DEGseq 软样本间相同基因的表达量进行差异分析，并以 FDR(false discovery rate2Fold≥1(快速生长组/慢速生长组)为阈值，筛选差异表达基因(Differesed unigene)。FPKM[82]是目前计算基因表达量最常用的方法，其是指每中来自某一基因每千碱基长度的 Fragment 数目。其计算公式为： =106 3公式 (2-1)
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【参考文献】
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1 王忠良;丁q
本文编号：2819115
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/2819115.html
