芽孢杆菌V4和胶红酵母对鲑鳟鱼生长免疫及肠道菌群影响研究

发布时间：2020-09-17 16:46

　　鲑鳟鱼是世界性的主养冷水鱼类,其肌肉富含人体必需的氨基酸、不饱和脂肪酸等,是优质的高端水产品,市场需求巨大。工厂化循环水养殖是实现鲑鳟鱼高密度、高品质、高产量的重要生产方式之一,目前,高密度循环水条件下的鲑鳟鱼养殖出现了诸如鱼类病害多发等问题,制约着鲑鳟鱼养殖业的快速可持续发展。亟需从加强鱼体健康的角度出发,探究出一条生态安全可行的鲑鳟鱼疾病预防策略,在此情形下,筛选和研制高效的益生型菌株,应用于鲑鳟鱼工厂化养殖过程,是改善鱼类健康、增强鱼类抵抗病原菌能力的优先策略。本研究以大西洋鲑和虹鳟为研究对象,将筛选研制的具有特殊拮抗活性的潜在益生型菌株应用于鲑鳟鱼工厂化养殖,探究其对鲑鳟鱼的益生效果,从鱼类生长,存活,免疫、拮抗病原菌能力,肠道微生物菌群结构等多角度进行综合评价,为后续商业化推广和应用提供坚实的理论基础。本研究的主要成果如下:1.通过采集健康及患病大西洋鲑鱼,初步构建了感染杀鲑气单胞菌的鲑鳟鱼致病模型,联合运用DGGE和16S r RNA基因测序技术,深入探究鲑鳟鱼肠道内微生物菌群结构,以期查明鱼类健康状态与肠道微生物菌群之间的关系,研究发现:健康大西洋鲑肠道中的主要微生物组成为变形菌门(Proteobacteria,44.33%),放线菌门(Actinobacteria,17.89%),拟杆菌门(Bacteroidetes,15.25%)和厚壁菌门(Firmicutes,9.11%),其中,Oxalobacteraceae科和微球菌科(Micrococcaceae)的某些属,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas),链霉菌属(Streptomyces),乳球菌属(Lactococcus)和Pedobacter菌属的细菌是健康大西洋鲑肠道中的优势菌属。然而病鱼肠道内优势微生物门类则稍有差异,主要为变形菌门(Proteobacteria,70.46%),拟杆菌门(Bacteroidetes,7.59%),厚壁菌门(Firmicutes,7.55%)和绿弯菌门(Chloroflexi,2.71%),气单胞菌科(Aeromonadaceae)和腐螺旋菌科(Saprospiraceae)的某些属,Aliivibrio菌属,弧菌属(Vibrio),和梭菌属(Clostridium)是病死鱼肠道中的优势菌属,研究证实健康大西洋鲑与病鱼肠道中微生物菌群结构存在显著差异。基于实验室严格控制条件下所构建的精准大西洋鲑致病菌侵染模型研究发现,杀鲑气单胞菌侵染急剧降低了大西洋鲑肠道中微生物菌群种类,且随着攻毒浓度的升高逐步下降,同时造成大西洋鲑肠道微生态平衡的严重破坏,显著降低大西洋鲑肠道微生物菌群多样性,鱼类肠道微生物菌群与鱼类健康状态之间关系紧密。2.验证了筛选的芽孢杆菌V4菌株和胶红酵母复合菌剂对工厂化循环水养殖虹鳟的益生效果。分别发酵芽孢杆菌V4(B.velezensis V4)和胶红酵母(R.mucilaginosa)制备复合菌剂,添加投喂虹鳟,探究其对于虹鳟幼鱼生长、存活、饵料利用等方面影响,同时综合运用PCR-DGGE指纹图谱分析及基于16S r RNA基因的高通量测序技术研究复合菌剂对虹鳟胃及肠道黏膜微生物、肠道内容物中微生物菌群影响,研究发现:T1菌剂添加组(B.velezensis V4/R.mucilaginosa,5×106/5×107 CFU/g)虹鳟的增重、特定生长率均显著提升,饵料系数显著降低,而所有菌剂添加组虹鳟的存活率均显著改善。基于虹鳟肠道微生物菌群结构的UPGMA和PCo A分析显示,对照组与复合菌剂添加组肠道中微生物菌群结构并未显著差异,但复合菌剂添加组微生物菌群多样性(Chao1指数,Shannon多样性指数等)均有所提高,益生型嗜冷杆菌属(Psychrobacter),芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus),乳球菌属(Lactococcus)及链霉菌属(Streptomyces)在复合菌剂添加组得到有效提升,同时,潜在致病菌伯克氏菌属(Burkholderia)的丰度得到有效遏制。3.芽孢杆菌V4(B.velezensis V4)及胶红酵母(R.mucilaginosa)应用于大西洋鲑幼鱼养殖,实验的研究发现:添加复合菌剂能够显著促进大西洋鲑生长,提高存活率,提高饲料利用率,在养殖初始实验阶段,复合菌剂添加组大西洋鲑血清中丙二醛(MDA),谷丙转氨酶(GPT)和一氧化氮(NO)的含量显著降低(P0.05),同时,随着复合菌添加浓度的升高,血清中MDA、GPT和NO的含量持续降低。在T1菌剂添加组中(B.velezensis V4/R.mucilaginosa,5×106 CFU g 1/5×107 CFU g 1),血清中总超氧化物歧化酶(t-SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、总抗氧化力(T-AOC)和免疫球蛋白M(Ig M)的含量显著高于对照组(P0.05)。皮质醇(cortisol)的含量在所有复合菌添加组中均有显著提高(P0.05)。复合菌剂添加实验组攻毒后的累积死亡率低于对照组,表现出一定的优越性。复合菌剂显著提高了大西洋鲑幼鱼在杀鲑气单胞菌侵染后血清中总超氧化物歧化酶(tSOD)和过氧化氢酶(CAT)活力,同样,谷草转氨酶(GOT),谷丙转氨酶(GPT)和酸性磷酸酶(ACP)的活性在复合菌添加组有显著升高,尤其在感染后的48小时。溶菌酶活性(LZM)在T1和T3实验组中有部分提升,血清免疫球蛋白M(Ig M)和皮质醇(cortisol)的水平在复合菌剂添加组有显著提升,说明复合菌的使用能有效调控大西洋鲑鱼的免疫应答,尤其在杀鲑气单胞菌侵染后复合菌投喂组大西洋鲑表现出强烈的益生作用,同时对于大西洋鲑肠道微生物菌群微生态结构无显著影响。4.评估了单一芽孢杆菌V4菌株对鲑鳟鱼类的影响。经过70天的养殖实验及后续的杀鲑气单胞菌侵染实验,共同探究和验证了芽孢杆菌V4菌株对虹鳟的生长、存活、饲料利用、免疫能力、拮抗病原菌及肠道菌群的影响,综合结果发现芽孢杆菌V4添加能够提高虹鳟存活率,提高了饲料利用率,同时增强了虹鳟的免疫应答、抗氧化应激及拮抗病原菌能力,尤其在杀鲑气单胞菌侵染后芽孢杆菌V4投喂组虹鳟表现出强烈的益生作用,同时芽孢杆菌添加组,蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)丰度有升高趋势,甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)和鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)的丰度也随着芽孢杆菌V4添加浓度的增大而升高,且甲基营养型芽孢杆菌的增长趋势显著,综合结果显示芽孢杆菌V4对虹鳟肠道微生物菌群微生态结构无显著影响,未影响其肠道内原有菌群的微生态平衡。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S965
【部分图文】：

示意图,扩散盒,原位培养,环境微生物

第二章文献综述良使用相应培养基进行培分离(Davis et al., 2005)。许多细菌在长期的适应和进化过程中可能早已适应了栖息地的环境，所以有研员就模拟细菌在自然界的生长环境，以期分离未培养的微生物。其中比较经典的就散盒方法（diffusionchamber）的设计。科研人员在细菌培养过程中，设计种简易（图 2.1），上下两层覆盖能够允许周围环境中物质自由进出的聚碳酸酯膜，以模拟环境及环境中的营养，实验结果显示，他们成功的从海水沉积物中分离得到了些未被培养的细菌，随后又将这些细菌接种到固体培养基中培养，结果显示分离到的细菌需要在其他细菌的辅助下才能生长，显示出定的依赖性(Kaeberlein et al., 2利用相似原理研究人员还分离出很多之前不能培养的微生物(Bollmann et al., Nichols et al., 2008)。

基本原理,文献综述,保真性,微生物群落结构

第二章文献综述008)。理论上，DGGE 图谱中每条谱带代表代表微生物群落结构及多样性，同时可以通过，分析微生物组成。该技术方法最初由 Fischerd Lerman, 1979)，随后被广泛应用。为了使 DG在引物末端加入段富含 GC 的片段（GC-cl5)，提高 DGGE 的灵敏性和保真性，改进后的上的差异。

电泳图,微生物群落,正常鱼,大西洋鲑

死鱼肠道微生物群落变bial communities from h健康鱼样品；D1、D2mples collected from heafish, respectively鱼肠道微生物群落的群落结构相似性进物群落与病死鱼肠道CA 排序结果同样显示能很好的聚在起

【参考文献】