基于微卫星的黄喉拟水龟亲子鉴定技术的建立及应用

发布时间：2020-09-17 16:58

　　黄喉拟水龟(Mauremys mutica)是一种集食用、药用、观赏于一身的高值淡水龟类。由于经济开发造成生境破坏以及人为过度捕捞等因素的影响,黄喉拟水龟野生种群数量急剧下降,已被国家列为濒危物种。近年黄喉拟水龟的市场需求量越来越大,催生了黄喉拟水龟的人工养殖,并且养殖规模越来越大,已成为龟类养殖的热门种类之一。由于黄喉拟水龟性成熟时间较长,需要5年左右,产卵较少,一只母龟平均获苗3-4个,导致苗种供应严重不足,制约了养殖规模的进一步发展。因此,如何提高黄喉拟水龟的繁殖力是养殖行业目前急需解决的问题。本实验室近几年致力于提高黄喉拟水龟繁殖力的研究,而高繁殖力黄喉拟水龟品系选育是其中的一个研究方向。母龟繁殖力的高低需要由其后代数量来确定,而由大群体自由交配产生的后代其系谱难以确定,导致后续工作难以开展。因此,我们开发了基于微卫星的黄喉拟水龟亲子鉴定技术。本实验以132只同龄的黄喉拟水龟父母本,及其在2013、2014两年产的子代为实验材料,利用开发的微卫星标记构建多重PCR体系,进行遗传多样性和母龟与子代间的亲缘关系鉴定研究,根据鉴定结果确定繁殖力较高的黄喉拟水龟母龟个体,为高繁殖力亲本选育奠定基础。具体研究内容包括以下三方面:1.黄喉拟水龟微卫星引物的设计与筛选根据本实验室所测转录组数据中的微卫星序列设计44对微卫星引物,另外引用发表文献中的6对微卫星引物,共合成50对微卫星引物,对黄喉拟水龟亲本基因组DNA进行PCR扩增,共有34对引物的PCR产物条带清晰,且特异性较好。用包含30个个体的黄喉拟水龟亲本随机群体检测该34对微卫星引物多态性,其中6对引物在该随机群体中只有1个等位基因,其他28对引物的等位基因数均在4个及以上。该28个微卫星位点共检测到284个等位基因,单个位点等位基因数(Na)介于4-21之间,平均等位基因数10.1;多态信息含量(PIC)介于0.337-0.922之间,平均值为0.717,其中22个微卫星位点PIC0.5,表现为高度多态性,另外6个微卫星位点PIC0.25表现为中度多态性;观测杂合度(Ho)介于0.333-0.967之间,平均值为0.678;期望杂合度(He)介于0.396-0.942之间,平均值为0.754。无效等位基因频率均介于-13.63-43.31%之间。2.微卫星多重PCR体系的建立及其遗传多样性分析选用其中16对引物用于建立多重PCR,通过选择引物组合,以及优化引物浓度比例、退火温度、循环数、荧光接头浓度等反应参数,成功构建了两个均含8个微卫星位点的多重PCR体系。体系1包含的位点为:sg8、mmu13、mmu1、mmu7、mmu2、sg10、mmu3、mmu4,其混合比例为5:8:8:10:2:6:2:11;反应退火温度为57.5℃,循环次数为22;荧光接头浓度为2μmol/L。体系2包含的位点为sg3、sg16、sg11、sg29、sg22、sg5、sg23、sg27,其混合比例为:10:10:4:5:5:7:15:10;反应退火温度为62.5.5℃,循环次数为20;荧光接头浓度为1.2μmol/L。采用多重PCR体系和遗传分析仪ABI3130获得了亲本和子代群体在16个微卫星座位上的基因型数据。根据基因型数据分析了132只黄喉拟水龟亲龟与598只子龟的遗传多样性,结果表明亲本与子代群体在16个微卫星座位上均具有较高的基因变异程度,遗传多样性较丰富,且子代遗传多样性与较为丰富的一方亲本更为接近。3.黄喉拟水龟亲子鉴定及其在高繁殖力亲本选育中的应用依据89只母龟,以及2013年与2014年分别产的296只与302只子龟的基因型数据,先采用Cervus 3.0软件以2013年产的子代与候选母本组成的待检群体为例,进行在双亲基因型未知时亲本排除率分析:16个微卫星位点中单个位点的亲本排除概率介于9.2%与74.7%之间,累积排除概率为99.99%。然后对2013、2014两年产的子代与其母本群体进行亲缘关系鉴定,结果显示:在95%的置信度标准下,模拟鉴定率均接近100%,实际鉴定率分别为87%和94%。根据亲子鉴定结果,母龟在2013与2014两年产下的子代数据统计结果为:2013年可能有母龟没有产下后代,而2014年至少有一个母本未产下后代;母本m2、m16、m17、m23、m27、m38、m43、m73、m117、m124在2013年与2014年的子代数均不低于5个,表现出较高的繁殖能力,这些母本及子代都是黄喉拟水龟高繁殖力品系的选育对象。本实验中建立的微卫星多重PCR为黄喉拟水龟亲子鉴定提供了工具,而2013与2014两年的亲子鉴定实验,则是黄喉拟水龟高繁殖力亲本选育的前期工作,为后期分子辅助育种技术的开发奠定基础。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S966.5
【部分图文】：

黄喉拟水龟,基因组DNA

采用微量组织试剂盒法提取指甲DNA，在样品DNA含量较低，样品组织难以破碎的情况下，快速地提取到了质量较高的黄喉拟水龟基因组DNA，部分DNA如图1-1所示，目的条带位置在Marker DL15000bp最大片段条带上面，说明提取的黄喉拟水龟基因组DNA大于15000bp以上，完整性较好；拖带不是很明显，说明DNA降解片段较少。经分光光度计检测，浓度达到后续试验的要求，且大部分DNA OD(260/280)值介于1.8-2.0之间，说明纯度较高。图 1-1 黄喉拟水龟基因组 DNAMarker：DL15000bpFig1-1 The extracted total genomic DNA of Asian Yellow Pond TurtleMarker：DL15000bp2.2 引物设计及其筛选用50对引物在黄喉拟水龟基因组DNA中进行PCR反应，以检测其扩增效果及多态性。经电泳检测，共有34对引物有条带清晰

电泳图谱,黄喉拟水龟,微卫星位点,PCR扩增产物

18图1-2 4个微卫星位点mmu3(a)、mmu4(b)、mmu13(c)、sg8(d)引物在30个个黄喉拟水龟随机个体中的PCR扩增产物的毛细管电泳图谱。注：H 代表峰值，S 代表片段大小;在该个体中，位点 mmu3 与 mmu4 有一条峰，表明只有一个等位基因，位点 mmu13 与 sg8 有两条峰，表明有两个等位基因。Fig1-2 Electrophorograms of PCR products of primers of microsatellite mmu3(a)、mmu4(b)mmu13(c)、sg8(d) in 30 random Asian Yellow Pond Turtle.Note：H stands for peak value, S stands for fragment size; in the sample, there is onepeak ,which means one allele, in both locus mmu3 and mmu4; while two peaks, which mean twoalleles in both locus mmu13 and sg8.在电泳图谱中，通过 Peak Scanner Software V1.0 软件自动识别微卫星位点PCR 产物片段大小，从而区分不同的等位基因。1 个个体在一个微卫星座位上的

黄喉拟水龟,子代,基因组DNA

用镊子将保存在无水乙醇中的子代指甲从1.5mL离心管中取出，用灭菌水清洗去除组织中的酒精，用微组织DNA提取试剂盒大批量提取黄喉拟水龟基因组DNA(图2-1)，方法参考第一章1.3.1。图2-1 黄喉拟水龟子代基因组DNAmarker：DL15000 bp DNA marker

【参考文献】