大珠母贝CCT-α、CCT-β和CCT-η亚基基因全长cDNA的克隆及其冷应激表达

发布时间：2020-09-22 17:41

　　大珠母贝是生产大型海水珍珠的重要母贝,对海水温度的要求严格,生活的适温范围是25~30℃,不耐低温,了解大珠母贝对环境低温的反应机制有重要意义。本研究首次克隆到大珠母贝冷应激相关基因CCT-α、CCT-β和CCT-η基因cDNA序列全长,并对其在不同组织和急性冷应激下的表达模式进行了分析,以了解大珠母贝的低温反应机制,也为大珠母贝的耐寒性状选育工作提供参考。结果如下:1.大珠母贝CCT-α、CCT-β和CCT-η基因cDNA全长克隆和生物信息学分析利用RACE技术首次从大珠母贝中克隆获得CCT-α、CCT-β和CCT-η基因cDNA全长。CCT-α基因cDNA全长1803bp,开放阅读框为1608bp,编码535个氨基酸,在赤道结构域比其他物种少20个氨基酸,具有3个CCT家族蛋白签名序列:36KSSLGPVGLDKML48、57ITNDGATILKLLEVEHP73、85QDQEVGDGT94,包含三个保守的功能结构域:赤道结构域、顶端结构域和中间结构域,含有9个保守的ATP结合位点分别位于39-41、91、95、137、377、395、434、486和488位氨基酸残基处,6个蛋白质结合位点分别位于第1-3、256、457-461、463、525、527-535氨基酸残基处;大珠母贝CCT-α与海蜗牛(Aplysia californica)、斑马鱼(Danio rerio)、人类(Homo sapiens)CCT-α推导的氨基酸序列同源性分别为80.7%、77.1%、75.4%。获得CCT-β基因两个转录本,分别长1829bp和2289bp,含有相同的5’末端非编码区105bp,3’末端非编码区分别长591bp和131bp,两个转录本开放阅读框均为1593bp,编码530个氨基酸,具有3个CCT家族蛋白签名序列:38KSTLGPKGMDKIL50、58VTNDGATILKSIGIVNP74、86QDDEVGDGT95,包含三个保守的功能结构域:赤道结构域、顶端结构域和中间结构域,含有9个保守的ATP结合位点分别位于42-44、92、96、160、387、405、445、488和490位氨基酸残基处,含有一个DEAD box基序:377ILDEADRSL385,3个蛋白质结合位点分别位于第1-4、467、526-530氨基酸残基处;大珠母贝CCT-β与牡蛎(Crassostrea gigas)、斑马鱼(Danio rerio)、人类(Homo sapiens)CCT-β推导氨基酸序列同源性分别是90.4%、76.8%、75.8%。cct-η基因cdna全长1895bp,开放阅读框为1895bp,编码543个氨基酸,cct-η具有3个cct家族蛋白签名序列:37rttlgprgmdkli49、58isndgatilktldivhp74、86qdaevgdgt94,包含三个保守的功能结构域:赤道结构域、顶端结构域和中间结构域,含有9个保守的atp结合位点分别位于40-42、92、96、161、391、409、449、492和494位氨基酸残基处,3个蛋白质结合位点分别位于第1-4、250、543氨基酸残基处;大珠母贝cct-η与牡蛎(crassostreagigas)、海蜗牛(aplysiacalifornica)、斑马鱼(daniorerio)、人类(homosapiens)cct-η推导的氨基酸序列同源性分别是83.2%、81.2%、80.1%、79.3%。2.大珠母贝cct-α、cct-β和cct-η基因组织差异表达分析采用实时荧光定量pcr技术检测了cct-α、cct-β和cct-η基因mrna在大珠母贝心脏、闭壳肌、外套膜、鳃、肝胰腺、胃、唇瓣、腹足8个组织中的表达情况。研究结果显示,cct-α、cct-β和cct-η在大珠母贝各组织中均有表达。cct-α基因在鳃、外套膜和闭壳肌表达量较高,胃、腹足和唇瓣中表达量较低,肝胰腺和心脏中表达量最低。cct-β基因在鳃和闭壳肌中表达量亮较高,腹足和唇瓣次之,外套膜、心脏、肝胰腺、胃表达量较低。cct-η基因在闭壳肌中表达量最高,鳃中表达量其次,腹足、外套膜、胃和唇瓣中表达量较低,肝胰腺和心脏中表达量最低。cct-α、cct-β和cct-η在大珠母贝闭壳肌和鳃中均有较高表达,提示三者在闭壳肌和鳃中具有重要的的生理作用;而cct-α在外套膜中有较高表达,提示cct-α在外套膜中具有特别重要的作用。3.冷应激对大珠母贝cct-α、cct-β和cct-η基因表达的影响采用实时荧光定量pcr技术检测了20℃冷应激条件下24h内cct-α、cct-β和cct-η基因mrna在大珠母贝组织中的表达情况。结果显示,在低温应激条件下,三种cct基因表达量均呈现先增高后降低的趋势。cct-α在闭壳肌、肝胰腺、心脏6h时表达量显著上调,12h时仍保持较高的水平,24h时表达量显著下降至0h时表达水平;而在鳃和外套膜12h时表达量才显著升高,24h时表达量显著下降至0h时表达水平。cct-β在心脏、肝胰腺中在6h时表达量升至最高,12h时仍保持较高的水平,24h时回落至0h时水平,而在闭壳肌、鳃、外套膜12h时表达量显著升高,24h时表达量显著下降至0h时表达水平。cct-η在闭壳肌中cct-η基因在冷应激后12h时表达量升至最高,24h时回落至0h时表达水平以下;而在肝胰腺和心脏中cct-η基因在6h时表达量达到峰值,12h时表达量显著下降,回落至0h时表达水平,24h时表达量维持在此水平。冷应激后,大珠母贝各组织中CCT-α、CCT-β和CCT-η表达显著上调,但不同组织的冷应激响应模式不同,心脏和肝胰腺响应速度快于其他组织,提示冷应激时CCT-α、CCT-β和CCT-η对保护大珠母贝组织,特别是肝胰腺和心脏等组织具有重要的作用。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q78;S917.4

【参考文献】