池蝶蚌Dmrt1的分子特征与蛋白功能研究

发布时间：2020-09-22 21:42

　　 DMRT基因(double-sex and mab-3 related transcription factor)家族是含有一个高度保守的DM结构域,能够特异性地识别某些DNA序列的一类基因的集合,其功能涉及胚胎发育、性腺发育以及性别决定与分化等方面。本研究以池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)为实验对象,从转录组内筛选出类似DMRT基因家族的一个基因片段,设计引物采用RACE PCR技术获得一段1491bp的序列,经NCBI比对后发现与其他物种Dmrt1的相似度较高,遂命名为池蝶蚌Dmrt1(Hs-Dmrt1)。Hs-Dmrt1基因c DNA序列全长为1491bp,包括5’非编码区48bp、3’非编码区358bp、开放阅读框序列长1095bp编码364个氨基酸,1491bp不包括加尾信号AATAAA保守区序列和下游丰富的poly(A)序列。其中DM结构域长141bp,一共编码47个氨基酸,在这个结构域中存在一个十分典型的“C2H2C4”锌指结构。NCBI上检索比对的结果显示与其他物种DM结构域的同源性在65%-75%之间,与栉孔扇贝的同源性最高为75%,与人(Homo sapiens)的同源性最低为65%,利用Mega4.0软件中邻近法构建了Hs-Dmrt1氨基酸序列的系统进化树,进化树中Hs-Dmrt1与荣类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)的Dmr1同属一支,推测二者存在较大的亲缘关系。采用实时荧光定量PCR分别分析4龄成体蚌11个不同组织以及不同年龄段不同性别的池蝶蚌性腺中Hs-Dmrt1基因的差异表达。结果显示,在对比的11个组织,在精巢内的表达量最高,在血淋巴中的表达量最低,此外在其余9个组织中均检测到有不同程度的表达,其中在精巢中的表达量约是卵巢中的18倍;在1-5龄的池蝶蚌雌雄性性腺中均检测到Hs-Dmrt1的表达,其中1龄蚌雌雄性腺中表达量没有明显差异,2-5龄蚌中都表现为在精巢中的表达量明显高于卵巢,且在3龄蚌的精巢中表达量最高,约为1龄蚌精巢中的80倍。由此推断Hs-Dmrt1可能与精子的形成及性别的调控有关。根据获得的完整ORF框序列设计引物构建p ET-32a-Hs-Dmrt1表达载体,将测序正确的重组质粒转入表达菌BL21(DE3)中进行原核表达。诱导后得到包括标签在内的57KD左右的融合蛋白,纯化蛋白并定量后免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA间接法检测抗血清效价高于1:819200;并用Western blotting检测抗体的特异性。通过获得的结果得知制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的Hs-Dmrt1融合蛋白。最后采用免疫荧光技术将Hs-Dmrt1蛋白在精子及肝胰腺内进行定位,结果显示在该蛋白位于精子头部接近尾端的细胞核内,而在肝胰腺组织细胞中则分布在细胞质及滤泡膜上。实验提取了池蝶蚌的基因组DNA,用Dra I,Pvu II,Eco R V和Stu I四种内切酶建立了4个基因组文库。根据已获得的Hs-Dmrt1基因的c DNA序列,设计步移引物,以4个文库的DNA为模板,步移获得Hs-Dmrt1完整的基因组序列及其5’与3’侧翼序列共5139bp。利用生物软件对克隆得到的Hs-Dmrt1基因5’侧翼序列进行分析,确定了Hs-Dmrt1基因的转录起始位点TSS并在转录起始位点上游28bp处检测到典型的TATAbox。综合各生物在线软件预测分析可得,在Hs-Dmrt1基因5’侧翼序列中不仅发现了常见的几种转录因子结合位点,如转录激活蛋白AP-1、GATA-1、GATA-2、GATA-3、特化蛋白Sp1、p53肿瘤抑制因子等,还发现多个SRY和Sox5等性别相关转录因子的结合位点,推测Hs-Dmrt1存在性别调控通路的下游,并受到SRY与Sox5的调控。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

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RNA 的质量可以满足后续试验的要求。电泳图如图 2.1 池蝶蚌性腺总 RNA 电泳图谱Fig.2.1 The electrophoresis of gonad total RNA in H.schlegmrt1 基因 cDNA 全长克隆总 RNA 反转录获得的 cDNA 为模板，根据转录组引物进行验证，并用 RACE-PCR 的技术进行 3’和 5.2 所示：

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池蝶蚌性腺总RNA电泳图谱

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第二章 Hs-Dmrt1 基因 cDNA 的克隆及分子特征分析.3.3 Hs-Dmrt1 基因全长核酸序列分析使用 DNAMAN 软件 Hs-Dmrt1 基因 cDNA 序列及其推导的氨基酸序 2.3 所示，cDNA 全长 1491bp，包括开放阅读框 1095bp，编码 364 个氨计蛋白大小 40KD，理论等电点 pI=8.61。5’和 3’非编码区(UTR)分别为 385bp，3’端出现 AATAA 加为信号。红色下划线标出的部分为 DM 结含 47 个氨基酸。

【参考文献】