三角帆蚌免疫相关基因HSP70、TNFAIP8、GBP1及TLR2的克隆与表达分析

发布时间：2020-09-23 11:13

　　三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国特有的淡水良种育珠贝,易受病害威胁而遭受重大经济损失,开展三角帆蚌免疫相关基因研究具有十分重要的现实意义。本研究采用RACE技术,对高通量转录组测序所获得的三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)热休克蛋白70(HSP70)、肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNFAIP8)、干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)与Toll样受体2(TLR2)基因的长片段进行扩增,拼接得到这四种免疫相关基因的cDNA序列全长,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了HcHSP70和HcTNFAIP8基因在各组织中的表达分布情况及其应激表达情况,并采用Western-blot技术从蛋白质水平研究温度刺激对HcHSP70表达的影响。HcHSP70基因cDNA序列全长2298 bp,开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸,预测蛋白分子量大小为71.6 kDa。含有三个HSP70家族典型的标签序列,末端保守区域EEVD以及典型的重复位点GGXP。与其他物种HSP70同源性很高,最高达91%,通过构建系统进化树发现Hc HSP70与其它4种软体动物HSP70聚为一支。HcHSP70在肝胰腺中表达量最高,其次是性腺,而在鳃、外套膜及肌肉中的表达量较低。实时荧光定量PCR和Western-blot技术显示,鳃组织中HcHSP70 mRNA和蛋白的表达量随水温上升而上调,37℃时表达量显著上升到最高值,而40 ℃时表达量恢复至正常水平。HcTNFAIP8基因cDNA序列全长1179 bp,开放阅读框为573 bp,编码190个氨基酸,预测分子量大小为23.64 kDa。HcTNFAIP8与长牡蛎CgTNFAIP8相似性最高为71%,且在系统进化树的同一个分支上。实时荧光定量PCR结果显示:HcTNFAIP8在性腺中表达量最高,其次为肝胰腺,而在鳃、外套膜及心脏中表达量较低;HcTNFAIP8的表达并不受PGN的诱导影响,而在LPS刺激后,HcTNFAIP8表达量出现先显著下调再上调情况,最终恢复接近到正常值。HcGBP1基因cDNA全长为2418 bp,开放阅读框为1947 bp,编码648个氨基酸,预测分子量大小为76.28 kDa。同源序列比对发现HcGBP1与非洲爪蟾GBP1处于同一个大分支中;HcTLR2基因cDNA序列全长1177 bp开放阅读框为1032 bp,编码343个氨基酸,预测分子量大小为39.58 kDa,同源序列比对发现发现三角帆蚌与马氏珠母贝聚为一支。
【学位单位】：江西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

示意图,结构域,干扰素调节因子,示意图

图 1-3 GBP1 结构域示意图Fig. 1-3 Structure of GBP1 domain 的调控多通过顺式作用元件 ISRE 和 GAS 响应 IFN 等细胞因子通过与干扰素调节因子 1（IRF1）之间结合，或结合信号

示意图,结构域,示意图,细胞凋亡

图 1-4 TLR2 的结构域示意图Fig. 1-4 Structure of TLR2 domainLR2 的生物学功能R2 作为一种模式识别受体，在抗菌、抗病毒、促进细胞凋亡及促进

物种,基因,氨基酸,灰色

图 2-2 HcHSP70 基因与其他物种比对结果注：相同的氨基酸用黑色阴影表示，保守但不一致的氨基酸用灰色表示Fig. 2-2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of HSP70 with the sequenceof other HSP60 from different organismsNote：Identical amino acids are shaded in black. Other conserved but not consensus aminoacids are shaded in grey.

【参考文献】