饲料中不同蛋白含量对日本沼虾不同地方种群生长、免疫性能影响的比较研究

发布时间：2020-09-24 10:47

　　本文设置蛋白质水平为30%、36%、42%和48%的4种不同梯度的实验饲料,运用营养学、生理生化及分子生物学等研究方法,分析了不同蛋白质水平对淀山湖日本沼虾(Macrobrachium nipponense)生长性能、免疫性能以及抗亚硝酸盐胁迫的影响,同时克隆了与生长发育相关的蜕皮调控基因-几丁质脱乙酰酶1(CDA1)及与免疫相关的吞噬细胞蛋白(PAP),分析了二者在不同的营养条件下及不同组织的表达水平差异。在此基础上,进一步研究了不同地区不同地方种群的日本沼虾在不同的蛋白营养条件下生长、免疫性能的差异,并对不同种群之间的遗传多样性上进行了分析。本文的主要结果如下:1.不同蛋白含量饲料对淀山湖日本沼虾生长性能影响饲料中蛋白质含量在42%与48%时,日本沼虾的特定生长率、增重率、存活率显著高于其它组(P0.05)。随着蛋白质水平的提高,肝胰腺蛋白酶与淀粉酶活力也呈逐渐上升趋势,42%与48%蛋白含量组活性最高(P0.05),但两组之间没有明显差异(P0.05)。脂肪酶与纤维素酶各组差异不显著(P0.05)。肌肉中粗蛋白含量随着饲料中蛋白含量的升高而升高,48%组最高(P0.05),与42%组差异不显著(P0.05),显著高于30%与36%组(P0.05)。其余水分、粗脂肪,各组无明显差异。赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸等必需氨基酸随着饲料蛋白含量的升高而升高,48%组最高,但与42%组差异不显著(P0.05)。氨基酸总量与必需氨基酸均随着饲料蛋白质含量的升高而升高。日本沼虾CDA1基因全长2435p,包含开放阅读框(ORF)1632bp,编码535个氨基酸,5’端和3’端非编码区分别为29bp和684bp,3’端以polyA结尾。该蛋白质预测分析量为60.8kDa,理论等电点为4.58。RT-PCR结果表明,CDA1在肝胰腺、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。在肝胰腺和鳃的表达量随着蛋白含量的增高逐渐升高,在肌肉的表达量没有显著差异(P0.05)。2.饲料中蛋白含量对淀山湖日本沼虾抗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染、免疫性能及抗氧化的影响主要通过控制饲料中的蛋白质含量,探究了日本沼虾在不同营养条件下抗嗜水气单胞菌、抗氧化、免疫性能以及免疫相关基因的表达。结果表明:随着饲料中蛋白含量的提高,日本沼虾感染嗜水气单孢菌后的存活率逐渐上升,48%组最高,超氧化物岐化酶(SOD)与过氧化氢酶(CAT)活性也逐渐升高,但谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)各组差异不显著(P0.05),碱性磷酸酶(AKP)与溶菌酶(LSZ)随着饲料蛋白含量的升高而升高,48%组活性最高。PAP全基因序列包含开放阅读框(ORF)363bp,编码120个氨基酸,5’端和3’端非编码区分别为96bp和363bp,3’端以polyA结尾,蛋白质预测分析量为13.5kDa。RT-PCR结果表明,PAP在肝胰腺、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在肝胰腺和鳃的表达量随着蛋白含量的增高逐渐升高,在肝胰腺的表达量在96h内先升高后下降,24h后表达量趋于稳定,48h到96h后表达量基本不变。3.饲料中不同蛋白含量对淀山湖日本沼虾抗亚硝酸盐胁迫的研究以半数致死浓度13.3mg/L亚硝酸钠(Na_2NO_2)胁迫,研究饲料中不同蛋白质水平对日本沼虾抗亚硝酸盐胁迫的影响。结果表明:攻毒结束后随着饲料中蛋白含量的提高,日本沼虾钠钾ATP酶(Na~+K~+ATPase)和钙镁ATP(Ca~(2+)Mg~(2+)ATPase)活性逐渐升高,肝胰腺和鳃酸性磷酸酶(ACP)与碱性磷酸酶(AKP)的活性逐渐升高,组间差异显著(P0.05),但都低于对照组,肌肉中差异不显著(P0.05)。利用组织切片与透射电镜观察不同含量蛋白质饲喂后的日本沼虾肝胰腺在亚硝酸盐胁迫下的变化,发现在30%蛋白营养组的肝胰腺与对照组差异明显,电镜下显示细胞内损伤严重,随着蛋白含量的升高,与对照组差异减小,损伤有所减缓。4.饲料中不同蛋白含量对洞庭湖(DT)、淀山湖(DS)及洞庭湖(♂)和淀山湖(♀)杂交子一代日本沼虾生长及免疫性能影响,及生长与遗传多样性关系分析为了研究日本沼虾淀山湖(DS)群体、洞庭湖(DT)群体以及以DS为父本,DT为母本繁育子一代(DTDS)群体,在不同营养条件下生长与免疫性能的差异,以及生长性能与遗传多样性的之间的关系,设置蛋白质水平为30%、36%、42%的3种不同梯度的实验饲料,饲喂8周后测定生长与免疫性能,并利用11对高多态性的微卫星位点计算并统计了平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、多态信息含量、遗传杂合度、Hardy-Weinberg平衡偏离指数、遗传相似系数等数据。结果表明3个群体中DTDS的增重率和特定生长率在各个营养条件下均高于DS、DT,饲料系数DTDS低于DS、DT,存活率各组差异不显著。蛋白酶和淀粉酶在42%水平下DTDS显著高于其余其DS、DT(P0.05),在30%与36%各组差异不显著(P0.05),碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶,等随着饲料中蛋白含量的升高而升高,DTDS的在三个梯度下均高于DS、DT。微卫星分析结果3个日本沼虾群体均表现出较高的遗传多样性水平,其中平均期望杂合度均大于0.733,显示出较高的遗传多样性水平。Fst值介于0.00954~0.3171,属于中等偏下分化。实验中还发现了Mn10、Mn12、Mn33、Mn39与体重体长相关,其中Mn10位点的aa基因型与体重体长负相关,bb基因型与体重正相关,Mn12的aa基因型与体重负相关,ab基因型与体长负相关,Mn33位点的ee基因型与体重负相关,Mn39位点的bb基因型与体重体长负相关,据此推断与日本沼虾生长相关的的调控基因可能定位于这几个位点附近。不同种群标记杂合度与生长性能存在一定的线性关系,但是在不同营养条件下生长性能趋势与杂合度之间线性关系不显著。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S968.22
【部分图文】：

沼虾,饲料蛋白质水平,体重,生长性能

图 2-1 饲料蛋白质水平对日本沼虾终末体重的影响Fig. 2-1 Effect of different levels of protein content on the final weight of M. nipponense注：不同字母代表差异显著（P<0.05）Note：different letters are significantiy different（P<0.05）2.1.2.2 饲料中不同蛋白质水平对日本沼虾生长性能的影响表 2-2 各组日本沼虾的生长性能Tab. 2-2 Growth performance of M.nipponense in different groups饲料组增重率（%）存活率（%）特定生长率（%）饲料系数30% 84.28±2.81a57%±2.31a0.65±0.01a2.29±0.23a36% 89.81±2.79b59%±2.41a0.71±0.03b1.875±0.67b42% 96.49±2.78c65%±1.34b0.89±0.02c1.47±0.089c48% 98.67±2.79c64%±1.32b0.86±0.01c1.55±0.019c注：不同字母代表差异显著（P<0.05）

氨基酸组成分析,成熟肽

图 2-3 CDA1 编码蛋白的成熟肽氨基酸组成分析Fig. 2-3 Analysis on the amaino composition of mature peptide from MnCDA1根据 MnCDA1 编码蛋白的 cDNA 序列推导的氨基酸序列组成见图 2-2，其中色氨酸（Trp）比例最高（8.5%），其次为天冬氨酸（Asp）7.3%、谷氨酸（Glu7.1%、天冬酰胺（Asn）6.9%。2.4.2.2 MnCDA1 编码蛋白结构分析日本沼虾MnCDA1编码的蛋白包含一个几丁质脱乙酰催化结构域（194-469两个低密度脂蛋白受体 A 类结构域（119-153，119-150）。从图 2.4 MnCDA1 编码的二级结构可见，α螺旋 A 区明显少于β螺旋 B 区，此外，利用同源基因比对网站建立的 MnCDA1 编码蛋白的三围结构模式图，也证明β螺旋在二级结构中占据大范围空间。

示意图,结构位置,淀山湖,生长性能

MnCDA1编码蛋白的结构位置示意图

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