虾夷扇贝热胁迫基因克隆及甲基化状态研究

发布时间：2020-10-10 00:59

　　虾夷扇贝(Mizuhopectenyessoensis)自20世纪80年代初引入中国后迅速开展增养殖研究和实践。最近十年,虾夷扇贝出现了成长速度慢,苗产量低及大规模死亡等问题,使虾夷扇贝养殖业受到了巨大的经济损失,严重制约了我国贝类产业的发展。因此对贝类免疫系统的探索能有助于我们有效的控制扇贝疾病,从而更好的发展贝类养殖业。本文从已构建的虾夷扇贝c DNA文库中获得了2个ESTs序列,并设计相关的特异性引物,结合RACE技术克隆得到了这2个胁迫基因的完整c DNA序列,并对获得的全长序列进行了结构分析和功能预测。本论文针对这2个胁迫基因所做的主要研究内容如下:1.虾夷扇贝酚氧化酶基因克隆、序列分析及表达特性研究酚氧化酶是一种含铜的金属酶,广泛分布于微生物、动植物及人体中。该酶在无脊椎动物先天免疫防御中起着重要的作用。本文用分子克隆技术得到了虾夷扇贝酚氧化酶(TYR)c DNA基因全序列(Gen Bank登录号为KM408317),并利用Real-Time PCR方法分析了酚氧化酶基因在虾夷扇贝不同组织中表达概况以及鳗弧菌(Vibrioanguillarum)注射后不同时段的相对表达量。实验得到的酚氧化酶基因全长1850 bp,其包括长为1470 bp的开放阅读框,编码489个氨基酸,5’UTR和3’UTR分别为37 bp和343 bp。实时定量分析研究显示,酚氧化酶基因在肝胰腺、外套膜、肾、闭壳肌、鳃和血中都有表达,其中外套膜表达最高。鳗弧菌注射后6 h,TYR基因表达量显著低于对照组,而注射后12-36h,TYR基因表达量显著高于对照组,这一数据说明该基因可能在免疫过程中发挥重要作用2.虾夷扇贝热休克蛋白60基因克隆、序列分析、表达及甲基化状态研究HSP60(heat shock protein 60,热休克蛋白60)作为高度保守的热休克蛋白家族的一员,不仅可以在应激状态下帮助其他蛋白正确折叠并恢复天然构象,还可作为危险信号作用于天然免疫系统。基于HSP60的转录组序列设计特异引物,采用RACE技术成功克隆获得虾夷扇贝热休克蛋白60(HSP60)c DNA全序列(Gen Bank登录号为KP398510)。其c DNA序列全长3368 bp,包括68 bp的5’UTR,1569bp的3’UTR和1731 bp的开放阅读框,共编码576个氨基酸。利用基因步移技术扩增HSP60基因启动子区域序列并测序,获得HSP60基因启动子区域序列1236 bp,使用Ali Bata 2.1软件预测出该区域包含2个TATA盒,4个CCAAT盒,3个热激元件。通过比对10个扇贝启动子序列,并未发现了假定的SNP位点。基于氨基酸序列构建的系统进化树与传统物种进化规律基本吻合。通过实时PCR检测发现HSP60在虾夷扇贝各组织中均有表达,升温后肾脏中该基因的转录量升高极显著,而肝胰腺、外套膜、血淋巴和闭壳肌中的转录量升高显著(P0.05),说明该基因在热应激过程中发挥一定作用。通过BSP方法对虾夷扇贝DNA启动子区域及编码区甲基化程度进行了检测与分析,实验结果表明虾夷扇贝DNA甲基化发生在基因内部,即启动子区域并没有甲基化位点,而在编码区发生了甲基化。
【学位单位】：大连工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章文献综述
    1.1 虾夷扇贝概况
        1.1.1 虾夷扇贝分类学地位和形态学特征
        1.1.2 我国虾夷扇贝养殖现状和面临的问题
        1.1.3 虾夷扇贝的病害防治
        1.1.4 虾夷扇贝的分子生物学研究
    1.2 无脊椎动物先天性免疫
    1.3 虾夷扇贝酚氧化酶基因的研究现状
    1.4 虾夷扇贝热休克蛋白60基因的研究现状
    1.5 本研究的目的和意义
        1.5.1 本研究的目的
        1.5.2 本研究的意义
第二章 TYR基因克隆、序列分析、表达特性研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验样品
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 实验试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 RNA的提取
        2.2.2 RNA反转录
        2.2.3 TYR基因全序列的获得
            2.2.3.1 3’FULLRACE
            2.2.3.2 5’FULLRACE
        2.2.4 序列分析和系统发育树构建
        2.2.5 TYR基因相对转录量的测定
            2.2.5.1 定量引物设计以及相关性验证
            2.2.5.2 TYR基因在不用组织中的相对转录量
            2.2.5.3 鳗弧菌对虾夷扇贝鳃中TYR基因转录水平影响的测定
    2.3 结果与分析
        2.3.1 RNA的提取
        2.3.2 TYR全序列的获得及序列分析
        2.3.3 虾夷扇贝TYR氨基酸序列同源分析
        2.3.4 TYR序列同源性分析见图 4，参与比对的物种如下:
        2.3.5 TYR相对转录量的测定
            2.3.5.1 标准曲线相关性和产物单一性检验
            2.3.5.2 TYR基因在不同组织中的相对转录量
            2.3.5.3 鳗弧菌注射后鳃中TYR基因转录水平的影响
    2.4 讨论
第三章 HSP60基因克隆、序列分析、表达及甲基化状态研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验样品
        3.1.2 实验仪器
        3.1.3 实验试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 总RNA提取及反转录
        3.2.2 HSP60基因全序列的获得
        3.2.3 HSP60基因启动子区域序列的获得
            3.2.3.1 DNA的提取
            3.2.3.2 第一个内含子边界的确定
            3.2.3.3 基因步移特异性引物设计的原则
            3.2.3.4 基因步移
            3.2.3.5 查找HSP60启动子当中假定SNP位点
        3.2.4 序列分析和系统发育树构建
        3.2.5 HSP60基因相对转录量的测定
            3.2.5.1 定量引物设计以及相关性验证
            3.2.5.2 HSP60基因在不同组织中的相对转录量
            3.2.5.3 温度对虾夷扇贝鳃中HSP60基因转录水平影响的测定
        3.2.6 HSP60甲基化状态研究
            3.2.6.1 DNA亚硫酸氢钠修饰
            3.2.6.2 PCR扩增
            3.2.6.3 查找HSP60甲基化位点
    3.3 结果与分析
        3.3.1 总RNA的提取
        3.3.2 HSP60全序列的获得及序列分析
        3.3.3 HSP60启动子序列的获得
        3.3.4 HSP60基因启动子多样性分析
        3.3.5 HSP60氨基酸序列同源分析
        3.3.6 HSP60相对转录量的测定
            3.3.6.1 标准曲线相关性和产物单一性检验
            3.3.6.2 HSP60基因升温前后不同组织中的相对转录量
        3.3.7 HSP60甲基化状态分析
    3.4 讨论
第四章结论
参考文献
致谢

【相似文献】