栉孔扇贝基质蛋白cfMSP-1的基因克隆鉴定与功能探究

发布时间：2020-10-11 06:51

　　 栉孔扇贝(Chlamys farreri)是重要的经济养殖贝类,其贝壳的形成过程与其生长过程是密不可分的。本论文通过对栉孔扇贝贝壳的矿化相关基因cf MSP-1的克隆、定位与功能研究,旨在进一步探索栉孔扇贝的生物矿化机制,对现有的生物矿化理论也具有重要意义。通过对栉孔扇贝外套膜转录组数据分析,我们克隆了其表达量最高的cf MSP-1,通过RACE技术从外套膜组织中克隆获得cf MSP-1基因的c DNA全长。该基因全长为2912 bp,包括一个74 bp的5’非编码区,一个2406 bp的开放阅读框与一个432 bp的3’非编码区。其编码蛋白质的预测分子量约为71.3 k Da,理论等电点为3.36,经过信号肽预测分析,其N端含有一个20个氨基酸的信号肽。对不同组织的实时定量RT-PCR检测结果显示,cf MSP-1在外套膜组织中特异性表达,通过原位杂交技术进行精确定位,发现其在外套膜边沿部的外褶和向外边沿部分表达,结合信号肽预测结果,推测cf MSP-1可能由外套膜合成并分泌的基质蛋白。贝壳缺刻损伤引起cf MSP-1基因的表达量迅速上调,并且会持续保持在一个相对较高的表达水平。使用RNA干扰方法特异性敲低cf MSP-1基因的表达水平,同时通过扫描电子显微镜(SEM)观察贝壳簇叶层的形态结构发生明显变。根据上述实验结果推测cf MSP-1在栉孔扇贝贝壳簇叶层的形成中起关键作用。
【学位单位】：清华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 生物矿化
        1.1.1 生物矿化的定义
        1.1.2 生物矿物
        1.1.3 生物矿化机制
    1.2 软体动物生物矿化
        1.2.1 软体动物贝壳
        1.2.2 常见贝壳碳酸钙晶体结构
    1.3 软体动物贝壳基质蛋白研究
        1.3.1 软体动物贝壳基质蛋白研究方式
        1.3.2 软体动物贝壳基质蛋白的特征
        1.3.3 MSP-1 的研究进展
    1.4 栉孔扇贝
        1.4.1 栉孔扇贝简介
        1.4.2 栉孔扇贝贝壳的结构
        1.4.3 栉孔扇贝生物矿化研究
    1.5 研究目的与意义
    1.6 论文各部分主要内容
第2章 基质蛋白cfMSP-1 的克隆与基因序列分析
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 外套膜总RNA的提取
        2.2.2 cfMSP-1 开放阅读框的获得和序列确定
        2.2.3 cfMSP-1 的cDNA末端快速扩增
        2.2.4 生物信息学分析cfMSP-1 基因
    2.3 结果
        2.3.1 栉孔扇贝的外套膜总RNA的完整性
        2.3.2 栉孔扇贝外套膜cDNA文库建立以及cfMSP-1 基因克隆
        2.3.3 cfMSP-1 cDNA序列全长的获得
        2.3.4 cfMSP-1 基因序列分析
        2.3.5 cfMSP-1 氨基酸序列分析
    2.4 讨论
        2.4.1 栉孔扇贝cfMSP-1 基因的克隆
        2.4.2 cfMSP-1 基因序列特征
第3章 基质蛋白cfMSP-1 的功能研究
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 利用RT-PCR分析cfMSP-1 组织表达特征
        3.2.2 原位杂交定位cfMSP-1 的精确表达位置
        3.2.3 贝壳修复损伤实验
        3.2.4 RNAi实验
        3.2.5 贝壳结构扫描电镜观察
        3.2.6 栉孔扇贝贝壳中基质蛋白的提取
        3.2.7 体外表达cfMSP-1 重组蛋白
    3.3 结果
        3.3.1 定位cfMSP-1 表达位置
        3.3.2 贝壳损伤后cfMSP-1 基因的相对表达量变化
        3.3.3 cfMSP-1 在贝壳形成过程中的作用
        3.3.4 栉孔扇贝贝壳基质蛋白的提取
        3.3.5 栉孔扇贝cfMSP-1 重组蛋白表达
    3.4 讨论
        3.4.1 cfMSP-1 在栉孔扇贝各组织中的表达分布
        3.4.2 cfMSP-1 蛋白的生物功能研究
第4章 结论与展望
    4.1 结论
    4.2 展望
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

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本文编号：2836237