仿刺参C型凝集素及其介导的免疫应答机制的初步研究

发布时间：2020-10-12 21:50

　　 C型凝集素是一类含有糖识别结构域(Carbonhydrate recognition domain,CRD)的超家族,是固有免疫系统中的重要模式识别受体(Pattern-recognition receptor,PRR)。本研究以棘皮动物仿刺参(Apostichopus japonicus)为材料,综合利用生物信息学、分子生物学和免疫学等技术开展了对含单个CRD的C型凝集素(SJL-1)和含有多个功能结构域的C型凝集素(AjCTL-2)的分子克隆、蛋白表达及免疫学功能研究,并结合各自的结构特征探讨其糖识别机制,阐释了仿刺参C型凝集素在免疫防御中的作用。本论文对含DPN/WVD基序的单CRD结构域的C型凝集素SJL-1进行了免疫识别和结合活的性研究。发现SJL-1在仿刺参的管足、体壁和呼吸树等水管系统中特异性分布。同时,体腔细胞中的SJL-1能够响应灿烂弧菌刺激,在12小时时其mRNA表达水平显著上调。体外重组SJL-1蛋白(rSJL-1)能结合LPS、PGN、Mannose和D-galactose,具有广谱的病原体相关分子模式(PAMPs)结合活性。此外,rSJL-1能结合耶罗维亚酵母、毕赤酵母、金黄色葡萄球菌、短双歧杆菌、鳗弧菌和灿烂弧菌,且SJL-1的所有体外结合活性均需要Ca~(2+)的参与。以上结果表明SJL-1能够作为模式识别受体,含有单一的CRD结构域,具有广谱依赖Ca~(2+)的PAMPs和微生物识别活性。为了进一步了解仿刺参C型凝集素的结构与功能特征关系。本论文对含三个不同的功能结构域的AjCTL-2进行了免疫功能研究。AjCTL-2的三个功能结构分别为low density lipoprotein receptor class A(LDLa)、C1r/C1s/Uegf/bone morphogenetic protein 1(CUB)和一个CRD。位于Ca~(2+)结合位点2的关键氨基酸基序为EPN/WND。mRNA水平检测到该蛋白在仿刺参的体腔细胞中高表达。在仿刺参受到灿烂弧菌刺激后,体腔细胞中AjCTL-2的mRNA表达水平在12小时时显著上升。我们还检测到AjCTL-2的重组蛋白(rAjCTL-2)能够在体外不依赖Ca~(2+)结合D-galactose,但是rAjCTL-2对LPS、PGN和Mannose的结合活性却未检测到。除此之外,r AjCTL-2能结合短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、鳗弧菌(Vibrio auguillarum)和耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica),且rAjCTL-2的体外菌结合能力不依赖Ca~(2+)。本论文研究的两种不同的仿刺参C型凝集素均能作为模式识别蛋白识别并结合PAMPs及微生物,在仿刺参免疫防御过程中发挥重要作用。研究成果丰富了解棘皮动物免疫识别分子的结构与功能,为阐明棘皮动物的免疫防御机制奠定了基础。
【学位单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

2图 1-1 脊椎动物 C 型凝集素分类[2]Fig 1-1 Classification of C-type lectin in vertebrates集素的结构与功能集素的结构为止，C 型凝集素的判断标准是是否含有 CRD 结构域，已有的蛋白晶体表明，CRD 由 120 个左右的氨基酸残基构成，是具有双环结构的结构域由两个位于侧翼的 α-螺旋和若干位于结构内部反向平行的 β-折叠组成结构由四个非常保守的半胱氨酸残基（C1-C4）成型的二硫键连接，其着整个环状结构，而 C2 和 C3 则连接由反向平行的 β-折叠构成的“长”结构是 CRD 与 Ca2+及糖类结合的关键部位[11]。部分的 CRD 含有一 β-发夹结构，由一对半胱氨酸残基（C0，C0’）形成的二硫键将其固定

图 1-2 CRD 高级结构图[2]Fig 1-2 Tertiary structure of CRD过对多个 C 型凝集素的结构解析发现 CRD 一般含有 4 个位点的位置不仅取决于 CRD 的氨基酸序列，同时也与Ca2+结合位点 1，2 和 3 通常位于 CRD 的 β-发夹结构附间的盐桥有关[13]。在这 4 个 Ca2+结合位点中，Ca2+糖类的关键位点。C 型凝集素的糖识别活性和结合特异质子受体的位置来决定的[14]。与 Ca2+结合的氨基酸通形成复合体，这些氨基酸残基形成了两组关键的氨基酸酸基序是“EPN”（谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸）或“QPD”（。蛋白晶体结构学研究表明：关键氨基酸基序由“EPN”点 2 的结构发生重大变化，而是与糖结合平面上质子互换，进而使氢键结合的方向由 mannose-型转换为 gala凝集素素的突变体结合特异性研究，生物学家发现：在

Ca2+与糖的氨基酸侧链形成配位键；绿色虚线箭头代表氢键；箭头的方向供体到质子受体的方向图 1-3 CRD 的 Ca2+结合位点 2 与 Mannose 的结合图[14]Fig 1-3 Ca2+binding site 2 of CRD bind to Mannose的功能 世纪末科学家就提出了模式识别的理论，即尽管病原微生物的它们都编码一类结构高度保守且种类有限的病原相关模associated molecular patterns, PAMPs）[18, 19]。 PAMPs 存在于病原内部以维持微生物的生长和繁殖[19]。宿主通过编码合成不同的）来识别不同的 PAMPs，这种识别作用被称为模式识别[10]。 C R 家族的成员，能够通过识别微生物表面多种 PAMPs 进而结合Dectin-1 能够特异性识别真菌表面的葡聚糖，是机体抗真菌感染
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本文编号：2838323