感染嗜水气单胞菌草鱼肠道菌群结构研究

发布时间：2020-10-13 01:29

　　 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是导致淡水鱼类细菌性败血症的主要病原,广泛存在于世界各地,流行地域广、感染种类多,对不同生长阶段的鱼类均致病。因发病周期长、致死率高,往往给水产养殖业造成巨大的经济损失。多年来,抗菌素一直是渔业生产中防治病害发生的主要手段,也对水产品安全和环境安全带来威胁。目前,替代抗菌素的水产益生菌应用已成为水产动物病害防控的研究热点和期望,水产动物肠道微生物菌群是开发益生菌重要的来源之一,具有很好的研究前景。本研究采集养殖水域中患不同程度细菌性败血症的草鱼(Ctenopharyngodon idellus),在病原菌分离、鉴定的基础上,研究发病不同程度草鱼组织中致病菌感染量、肠道菌群结构变化,探讨致病菌与肠道菌群种类、数量之间的关系;进一步通过人工长期感染该致病菌,弄清草鱼肠道优势菌群变化规律与致病菌数量的关系,试图发现草鱼肠道菌群中拮抗致病菌的有益菌,为开发草鱼专用抗病有益菌提供基础。获得研究结果主要为:1.患病草鱼致病菌的分离、鉴定:从汉中市水产实验站采集患病草鱼,通过无菌操作从病灶初步分离得到3株不同形态的细菌,其中ZB-1编号菌株数量最多,对草鱼的回感攻毒试验中ZB-1菌株致死率为90%,其余2株很低,确定ZB-1菌株为目标菌株,经生理生化试验和16S rRNA基因序列比对,鉴定病原菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。2.患病草鱼肠道菌群结构研究:实时定量PCR检测草鱼组织中致病菌的感染量,对采集的9尾病鱼进行致病菌感染量分析并分为A、B、C三组。通过Illumina MiSeq测序系统检测草鱼肠道菌群结构,发现随着A、B、C三组草鱼肾致病菌感染量的逐渐增加,门水平上的主要优势菌门厚壁菌门(Firmicutes)所占的比例下降了20%左右,变形菌门(Proteobacteria)所占的比例下降了10%左右,梭杆菌门(Fusobacteria)呈现明显的上升趋势,平均升高了近20%。属水平上的主要优势菌属芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)所占的比例都平均下降10%左右,鲸杆菌属(Cetobacterium)所占比例呈现明显的上升趋势,平均升高了近20%。3.人工感染嗜水气单胞菌草鱼肠道菌群结构变化研究:3个不同浓度致病菌长时间浸泡感染草鱼,在3 d、6 d、9 d、12 d、15 d取得样品。通过MiSeq测序系统检测草鱼肠道菌群结构,发现在门水平上,感染3d时,处理组厚壁菌门所占比例与对照相比均下降了约15%,而后均随时间的延长呈现上升趋势;变形菌门所占比例从整体来讲,处理组均比对照要低;梭杆菌门所占比例在感染3d时与对照相比,有5%~30%的上升,之后达到最高后再降低。属水平上,感染3d时,处理组芽孢杆菌属所占比例与对照相比均有15%~20%降低,而后均随时间的延长呈现上升趋势;与对照相比,假单胞菌属和乳球菌属所占比例随时间的延长均呈上升趋势,相反气单胞菌属(Aeromonas)所占比例有15%~20%的大幅下降;处理组鲸杆菌属所占比例在感染3d时与对照相比,有10%~30%的上升,之后达到最高后再降低。以上结果表明,当受到嗜水气单胞菌感染时,草鱼肠道菌群中的主要优势菌门厚壁菌门和变形菌门所占比例均会随致病菌感染量的升高而降低,梭杆菌门所占比例会上升;主要优势菌属芽孢杆菌属所占比例会随致病菌感染量的升高而降低,鲸杆菌属所占比例会升高,气单胞菌属所占比例会下降。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S943
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 嗜水气单胞菌的危害及疾病控制方法
        1.1.1 嗜水气单胞菌的危害
        1.1.2 疾病的控制方法
    1.2 鱼类肠道菌群的形成与作用
        1.2.1 鱼类肠道菌群的形成与分布
        1.2.2 肠道菌群的营养作用
        1.2.3 肠道菌群的屏障作用
    1.3 水产病原菌拮抗菌的研究
    1.4 本研究的目的意义
第二章 患病草鱼致病菌的分离、鉴定
    2.1 试验材料
        2.1.1 试验动物
        2.1.2 试验试剂
        2.1.3 试验仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 致病菌株的分离纯化
        2.2.2 分离菌株的回感试验
        2.2.3 致病菌的生理生化试验
        2.2.4 致病菌的分子生物学鉴定
    2.3 结果与分析
        2.3.1 致病菌的分离
        2.3.2 分离菌株致病性的确定
        2.3.3 致病菌的生理生化特性
        2.3.4 16S rRNA基因测序结果
        2.3.5 系统进化树的构建
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 患病草鱼肠道菌群结构研究
    3.1 试验材料
        3.1.1 试验动物
        3.1.2 试验试剂
        3.1.3 试验仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 样品采集
        3.2.2 组织中致病菌感染量检测
        3.2.3 肠道菌群DNA提取与 16S rRNA基因扩增
        3.2.4 Illumina MiSeq高通量测序
        3.2.5 高通量测序数据处理与分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 组织中致病菌感染量
        3.3.2 MiSeq测序质量评估
        3.3.3 肠道菌群丰富度和Alpha多样性指数
        3.3.4 肠道菌群群落结构多样性
        3.3.5 肠道菌群Beta多样性分析
        3.3.6 肠道菌群群落物种丰度图
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 人工感染嗜水气单胞菌草鱼肠道菌群结构变化研究
    4.1 试验材料
        4.1.1 试验动物
        4.1.2 试验试剂
        4.1.3 试验仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 嗜水气单胞菌ZB-1 培养与计数
        4.2.2 嗜水气单胞菌感染草鱼与样品采集
        4.2.3 肾脏中致病菌感染量检测
        4.2.4 肠道菌群DNA提取与 16S rRNA基因扩增
        4.2.5 Illumina MiSeq高通量测序
        4.2.6 高通量测序数据处理与分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 草鱼肾脏中致病菌感染量
        4.3.2 MiSeq测序质量评估
        4.3.3 样本菌群丰富度和Alpha多样性指数
        4.3.4 肠道菌群群落结构多样性
        4.3.5 肠道菌群Beta多样性分析
        4.3.6 肠道菌群群落物种丰度图
    4.4 讨论
    4.5 小结
结论
参考文献
致谢
作者简介

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本文编号：2838551