哈维弧菌致病性及其T6SS相关基因的克隆与敲除研究

发布时间：2020-10-13 01:55

　　 哈维弧菌(Vibrio harveyi)作为海水养殖业重要的致病菌,可感染多种鱼、虾、蟹等并造成大量的死亡,在水产养殖工作中受到高度重视。VI型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)是革兰氏阴性菌中近几年新发现的分泌系统,目前已有很多研究证明其是与细菌毒力相关的一个跨膜蛋白分泌系统,由多种蛋白复合体构成,在病原菌接触到宿主细胞后启动,并将效应蛋白输送到宿主细胞内,对宿主产生毒害作用。在多数的霍乱弧菌(V.cholerae),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),溶藻弧菌(V.alginolyticus),鳗弧菌(V.anguillarum),根瘤菌(Rhizobium),大肠杆菌(Escherichia Coli)等阴性菌中存在。本文研究了哈维弧菌的耐药性及致病力,对实验室分离到的哈维弧菌致病菌株T6SS转运蛋白vgr G和效应蛋白rbs B基因进行了克隆分析,构建了转运蛋白vgr G基因突变株,探究哈维弧菌T6SS在其致病机制中作何作用。结果如下:1.对南海沿岸海水养殖鱼类128株分离株进行鉴定,将rct B-tox R基因串联,运用邻接法(Neighbor-Jonining,NJ)构建系统进化树,最终确定90株为哈维弧菌。采用K-B法对90株哈维弧菌分离株进行抗生素耐药性分析,通过系统聚类法以平方Euclidean距离来分析菌株间的耐药性同类关系,结果显示:90株哈维弧菌共有耐药谱26种,谱型丰富度为28.9%。其中,多重耐药谱(耐3类及以上抗生素)21种,包含菌株共35株,占总菌数38.9%。从时间分布上看,2012、2013和2014年分别具有10、18和8种耐药谱型,从地区分布上看,海南、广东和广西三个地区包含17、13和2种耐药谱型,时间与地区的耐药谱型差异明显。90株哈维弧菌样本聚类分析得到group I、group II和其他组群,分别含有11、12和4种耐药谱,耐药谱型率分别为16.9%、57.1%和100%,而group I和group II组群进而分为5个亚群i~v。结果表明,在广东、海南和广西地区养殖鱼类中所分离到的哈维弧菌耐药谱具有复杂多变的特征,随着时间年份的递增,哈维弧菌耐药谱种类也发生着更新变化,耐药谱不断扩大延伸。2.自2007-2014年的173株哈维弧菌对斑马鱼的攻毒实验显示,斑马鱼致死率100%的菌株数为45株,占总菌株数的26%;而致死率0%的菌株数18株,占总菌数的10.4%。斑马鱼腹腔注射攻毒后48h是斑马鱼快速死亡的时间段,说明哈维弧菌是一种快速致死宿主的病原菌。自海南陵水和广东深圳养殖场患病珍珠龙胆(pearl gentian)分离得到两株病原菌(X12XC30和X13SZ03),对菌株常规生理生化检测,以及16S r DNA,rct B和tox R等管家基因的检测结果综合鉴定,生理生化指标与哈维弧菌极为相似,根据管家基因的序列建立的系统进化树,自然地与哈维弧菌分支聚类,可以确定这两株菌为哈维弧菌。两株菌对珍珠龙胆的回归感染实验显示,其半数致死量LD50分别是6.58×106 CFU.g-1和9.83×105 CFU.g-1,证明哈维弧菌对珍珠龙胆具有很强的致病性。3.对哈维弧菌T6SS的vgr G和rbs B基因PCR扩增,分别得到930bp和801bp的开放阅读框,编码310aa和267aa,用信号肽分析软件Signal P 3.0对其序列分析发现,vgr G基因是编码T6SS的一个转运蛋白,发现该蛋白在1-39 aa的位置有信号肽区域,且序列具有“COG3501”结构域;rbs B基因是编码T6SS的一个效应蛋白,并且发现该蛋白在在1-43 aa的位置有信号肽区域,且具有“COG1879”结构域。4.利用http://nebuilder.neb.com/系统设计带有粘性末端的缺失vgr G基因的上下游片段引物,引物与p WS7848质粒引物有相同的粘性末端,PCR扩增得到V-UP、V-DOWN和p SW7848片段。然后采用等温重组的方法构建p SW7848-?vgr G重组质粒,经过两次转换细菌感受态培养;再与哈维弧菌170EGH进行接合转移。利用TCBS+5ug/m L Cm+0.2%Glucose筛选具有p SW7848-?vgr G重组质粒的哈维弧菌,最后利用LBS+0.2%arabinose培养基阿拉伯糖促使启动子p BAD控制ccd B表达毒性杀死质粒,PCR检测获得最后的缺失vgr G基因的哈维弧菌株。野生株致死率为70%,基因缺失株致死率为30%,缺失株致死率明显低于哈维弧菌野生株。说明vgr G基因所属的T6SS在哈维弧菌致病过程中起重要作用。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S941.4
【部分图文】：

图 2-1 霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)的模式图Fig 2-1 Type VI secretion system (T6SS) model diagram of Vibrio cholerae1.2.2.3 T6SS 的结构蛋白发现 T6SS 后，至今对 IcmF 结构蛋白进行了较多深入的研究，包括其结构以及蛋白活性等，其还参与分泌 Hcp 导管的形成，敲除 icmF 的突变株，则上清中检测不到 Hcp 蛋白。2011 年，对禽病原性大肠杆菌（APEC）研究发现，T6SS 中的icmF 可能扮演致病因子的角色，也可能在病菌流行病传播过程，通过生物膜的形成并增强毒性[97]。AAA+ATP 酶的 ClpB 构成了 T6SS 的一个能量供应体系。2013年，克隆到爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）H51 溶血素共调节蛋白的编码基因 hcp，表达成功后并制备高效的多克隆抗体。vgrG 蛋白的结构与 T4 噬菌体尾穗蛋白质片段相似，形成一个复杂的 T6SS 注射器结构尾管，尾部尖端用于穿刺细菌细胞膜，之后脱落，T6SS 将蛋白分泌到宿主内[98]。1.2.2.4 T6SS 的转运蛋白缬氨酸-甘氨酸重复蛋白 G（VgrG）和溶血素共调节蛋白（Hcp）是 T6SS 中

上海海洋大学硕士学位论文（Hapalogenys nitens）、芝麻斑（Epinephelus sp）等；海南沿岸（包括海线陵水新村港、文昌烟堆、文昌铺前、三亚红沙、琼海谭门、黎安）主要宿主是乌鲳（Formio niger）、棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus趸、卵形鲳鲹、点篮子鱼、布氏鲳鲹（Trachinotus blochii）、东星斑ctropomus leopardus）、青石斑鱼、军曹鱼（Rachycentron canadum）和川Lutjanus sebae）等；一些菌株分离自广西北海地区棕点石斑鱼。

注：图 A-rctB 544bp，图 B- toxR 382bp。图 2-2 基因片段电泳检测结果Fig. 2-2 Results of amplified fragments by electrophoresising.2 系统进化树的构建将测序所得基因序列在 NCBI 中进行同源性分析，与参考序列，构建系统（图 2-3 至图 2-5）。90 株能扩增得到 toxR 基因的菌株建立的系统进化树 90 株病原菌都能够自然地聚类到哈维弧菌参考菌株分支上，且没有其他入其中；rctB 基因扩增的 110 株病原菌 109 株能自然的聚类到哈维弧菌参支上，仅 XC20 菌株离哈维弧菌分支较远；rctB-toxR 基因串联后，构建系树，可以得到 90 株病原菌自然聚类到哈维弧菌分支上，确定这 90 株为哈。
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本文编号：2838573