传染性造血器官坏死病（IHN）核酸疫苗的构建及其安全性的初步探究

发布时间：2020-10-13 20:22

　　 传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)隶属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)诺拉弹状病毒属(Novirhabdovirus),是传染性造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis,IHN)的病原体。IHN是鲑鳟鱼类的最主要病毒性疾病之一。IHN的爆发会导致鲑鳟鱼苗高达100%的死亡率,对世界鲑鳟鱼类养殖业造成了巨大的经济损失,严重阻碍了鲑鳟鱼养殖业的健康发展。自1953年IHN在北美引起人们关注以来,陆续在日本、欧洲和韩国也检测到了IHNV,1988年传入到中国。目前没有治疗IHN的有效药物,国外商品化的IHN核酸疫苗由于存在毒株变异及生物安全因素无法直接引进及应用。本研究利用我国IHNV分离株,构建了针对我国现行IHN的核酸疫苗,并在此基础上初步开展了核酸疫苗在虹鳟接种部位的动态分布研究及疫苗载体青霉素抗性基因对环境微生物的影响。本研究将我国IHNV分离株SD-12糖蛋白(Glycoprotein,G)基因克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)构建了IHN核酸疫苗(命名为pIHNsd-G)。采用背鳍基部肌肉注射的方式,以2μg/尾的剂量免疫虹鳟(Oncorhynchus mykiss)鱼苗(5±0.5g)。在免疫后第4、30、60及150天,以IHNV分离株SD-12 100倍半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose,TCID50)采取腹腔注射的方式进行攻毒试验,计算核酸疫苗相对保护率(Relative percent survival,RPS);于免疫后第4天及第7天,利用Real-time PCR技术检测免疫虹鳟头肾及接种部位肌肉组织Mx-1基因表达情况;在免疫后第4天、第30天、第60天及150天检测免疫虹鳟血清IHNV中和抗体效价;在免疫后65天内,分别于不同时间点采集循环水池里的粪便、水以及虹鳟的肠内容物进行氨苄青霉素抗性菌的分离鉴定;分别于免疫后不同时间点,以核酸疫苗载体的启动子基因序列和氨苄青霉素抗性基因序列为目标基因,利用PCR方法监测核酸疫苗在免疫虹鳟接种部位的动态分布情况。攻毒试验结果显示在免疫后第4天和第30天的核酸疫苗相对保护率分别为93.4%和91.4%,在免疫后第60天和150天pIHNsd-G对虹鳟的保护率都能达到89%以上。该结果说明核酸疫苗pIHNsd-G对虹鳟具有良好的保护效果,能够抵抗IHNV对虹鳟的进攻。对免疫后第4天和第7天的头肾及接种部位肌肉组织RNA中Mx-1基因的定量分析结果显示,与空白对照组相比,Mx-1基因在两种组织中均显著上调表达(P0.01),这一结果为IHN核酸疫苗的早期非特异性免疫保护提供了合理的解释。中和抗体的效价结果显示:在免疫后第4天,所有血清中均不存在中和抗体(效价均20);在免疫后第30天,只有两尾鱼的血清中不存在中和抗体,而剩余的8尾鱼血清中均存有效价不同的中和抗体,其中最高效价高达160;在免疫后第60天,所有免疫虹鳟血清中均存在中和抗体,其最高效价高达320;在免疫后第150天,有一尾鱼的血清中不存在中和抗体(效价20),而剩余的9尾鱼血清中均存在不同效价的中和抗体,其中一尾鱼效价最高(80)。该结果说明pIHNsd-G能够刺激虹鳟特异性免疫反应,而使免疫虹鳟产生中和IHNV的抗体,因而能够阻挡IHNV的进攻。抗性菌分离结果显示:分离到的氨苄青霉素抗性菌均是天然具有氨苄青霉素抗性的气单胞菌(Aeromonas sp)和柠檬酸杆菌(Citrobacter sp),并未分离到包括大肠杆菌在内的任何具有抗性的指示菌,且实验组和对照组的氨苄青霉素抗性菌的种类和数量均没有发生统计学意义的改变,证明了该核酸疫苗的抗性基因对虹鳟体内和及体外微生物环境都是安全的。pIHNsd-G在虹鳟接种部位的PCR监测结果显示:在免疫后的第1天即可在注射部位的肌肉中检测到全部pIHNsd-G目标片段,在84天时已经无法从注射部位肌肉中扩增出全长氨苄青霉素抗性基因,而所有目标基因在150天时均消失不见。本研究不但提供了具有良好保护效果的IHN核酸疫苗,还为IHN核酸疫苗的安全性评价研究提供了基础数据。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S948
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 鱼用核酸疫苗
        1.1.1 鱼类免疫基础
        1.1.2 核酸疫苗的免疫机理
        1.1.3 核酸疫苗的应用前景及安全性
    1.2 传染性造血器官坏死病（IHN）
        1.2.1 IHN的临床症状
        1.2.2 IHN的流行特点
        1.2.3 IHNV的生物学特征
        1.2.4 IHNV的基因组特征
        1.2.5 IHNV的基因编码的蛋白质特征
        1.2.6 IHNV的检测技术
        1.2.7 IHNV的防治
    1.3 研究展望
    1.4 本试验研究的目的和内容
第二章 材料与方法
    2.1 试验材料
    2.2 引物设计与合成
    2.3 IHNV病毒繁殖
    2.4 RNA的提取以及目的片段扩增
    2.5 表达载体pIHNsd-G的构建
    2.6 虹鳟的免疫
    2.7 样品采集
        2.7.1 组织采集与处理
        2.7.2 血液采集与处理
    2.8 表达载体pIHNsd-G的效果验证
        2.8.1 攻毒试验
        2.8.2 Mx-1 基因检测
        2.8.3 中和抗体效价测定
    2.9 核酸疫苗抗性基因环境释放的监测
    2.10 p IHNsd-G接种部位动态分布的监测
第三章 结果与分析
    3.1 G基因的扩增与表达载体p IHNsd-G构建
    3.2 pIHNsd-G保护效力分析
    3.3 Mx-1 基因检测结果
    3.4 中和抗体效价测定结果
    3.5 抗性菌的分离结果
    3.6 pIHNsd-G的接种部位动态分布
第四章 讨论
    4.1 G基因的扩增与表达载体p IHNsd-G构建
    4.2 pIHNsd-G保护效力分析
    4.3 抗性菌的分离结果
    4.4 pIHNsd-G的接种部位动态分布
结论
参考文献
附录
致谢

【参考文献】

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本文编号：2839663