罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白的制备及其免疫保护作用研究

发布时间：2020-10-13 20:50

　　 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),又称为B群链球菌(Group B streptococcus,GBS),革兰氏阳性菌,可导致多种动物(水生动物、哺乳动物)患病及人类多种疾病。近年来,中国罗非鱼养殖主产区暴发了严重的无乳链球菌病,冲击了中国罗非鱼产业的发展,经济损失严重,阻碍了中国罗非鱼产业的健康发展。抗生素治疗罗非鱼无乳链球菌病是目前采用的主要方法,但是抗生素的不合理使用会增加病原的耐药性。疫苗因具有高效、安全、无残留等特点是预防罗非鱼无乳链球菌病的潜在有效手段之一,也是目前研究的热点。无乳链球菌表面免疫原性蛋白Lrr G(Leucine-rich repeat protein from GBS)和Sip(Surface Immunogenic Protein)存在于各种血清型菌株中,高度保守,两者在抗罗非鱼无乳链球菌病方面均具有良好的免疫保护作用。有研究表明将两个或两个以上免疫原性基因融合,表达出的融合蛋白的免疫原性要优于单一蛋白。本研究试图将罗非鱼无乳链球菌的两个免疫原性基因Lrr G和Sip融合后表达,获得Lrr G-Sip融合蛋白,探讨该融合蛋白能否提供更好的免疫保护率。本研究首先根据序列分析,设计引物,扩增罗非鱼无乳链球菌的表面蛋白Lrr G和Sip基因,然后利用双酶切技术将基因Lrr G和Sip串联,中间添加具有生物学保护功能的疏水性多肽接头(Gly4Ser)3 linker序列,最后插入到原核表达载体p Cold II中,构建原核表达载体p Cold II-Lrr G-Sip,转入感受态细胞BL21(DE3),经过表达条件优化,成功诱导表达获得了Lrr G-Sip融合蛋白,并将纯化的融合蛋白注射免疫尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)。主要研究内容与结论如下:1.罗非鱼无乳链球菌Lrr G-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达提取无乳链球菌基因组DNA,查找目的基因Lrr G、Sip全基因序列,相关软件分析目的基因序列,结合原核表达质粒p ColdⅡ酶切位点和基因序列酶切位点设计引物。为使融合蛋白的生物活性尽量接近天然蛋白,在Sip上游引物中添加具有生物学保护功能的疏水性多肽接头(Gly4Ser)3 linker序列。鉴于Lrr G、Sip基因较大,通过重叠延伸PCR技术容易带来碱基突变,本研究采用基因拼接技术中的双酶切法分两步逐个将Sip和Lrr G基因插入p Cold II载体中,构建原核表达载体p ColdII-Lrr G-Sip。将成功构建的融合基因原核表达载体转化感受态细胞BL21(DE3),SDS-PAGE显示该融合蛋白以可溶和包涵体2种形式存在。通过控制变量的方法分别研究了IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对融合蛋白表达的影响,进行了诱导表达条件的优化。结果显示在15℃、IPTG 0.5 mmol·L-1、诱导9h的条件下,目的蛋白呈可溶状态的表达量最高。经His Bind亲和柱纯化、Western Blot检测结果显示Lrr G-Sip融合蛋白大小与预测一致(162k Da)。说明成功构建了融合基因,获得了Lrr G-Sip融合蛋白,为下一步罗非鱼源无乳链球菌Lrr G-Sip融合蛋白的免疫原性研究奠定了基础。2 罗非鱼无乳链球菌Lrr G-Sip融合蛋白免疫原性研究为探究无乳链球菌Lrr G和表面免疫原性蛋白Sip串联表达的Lrr G-Sip重组融合蛋白的免疫原性,本研究将原核表达的Lrr G–Sip重组融合蛋白分别以0.5μg/g(R1组)、1.0μg/g(R2组)和1.5μg/g(R3组)每尾200μL腹腔注射免疫尼罗罗非鱼,同时分别注射等同体积的1.0μg/g Sip蛋白(S组)、1.0μg/g Lrr G蛋白(L组)以及PBS(P组)作为对照,所有鱼体免疫两周后进行无乳链球菌人工攻毒,攻毒剂量为其半致死浓度LD50(4.0×108cfu/m L)。结果显示R1组对尼罗罗非鱼的相对免疫保护率最高,达89.14%;且免疫后14d和28d,该组鱼体血清抗体OD值分别达0.63和0.64,均显著高于单一蛋白组(S和L)和PBS组(P0.05);R1组鱼体血清过氧化物酶(POD)和碱性磷酸酶活性(AKP)在上述两个时间点也显著高于其它组(P0.05);但溶菌酶(LZM)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性与其它组之间差异不显著(P0.05)。初步表明Lrr G-Sip重组融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫原性明显优于单个蛋白,且能有效减少免疫剂量。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S943
【部分图文】：

-1、无乳链球菌表面蛋白基因 LrrG、Sip 的 PCR因的扩增产物；Sip：Sip 基因的扩增产物；Maplification of the surface protein gene LrrG and duct of LrrG gene; Sip: the amplification product o表达载体 pCold II-LrrG-Sp 基因和 pCold II 载体连接转化后，结果显示 Sip 正确插入到 pCold II 载 pCold II-Sip。然后，酶切后的 LrrG得阳性克隆(图 1-2，B)，酶切检测C)，测序结果同样显示成功构建 p

图 1-2、pCold II-LrrG -Sip 融合基因原核表达载体的构建与检测Fig.1-2 Establishment and verification of the fusion gene prokaryotic expression vector pCold II-LrrG-SipM：marker DL15000；Sip：Sip 的菌落 PCR；LrrG：LrrG 的菌落 PCR；EP：BamH I 酶单切过的 pCold II 空载体；PS：BamH I 酶单切过的载体 pCold II-Sip；PS1：BamH I 和 Sal I 双酶切 pCold II-Sip；PSL：BamH I 酶单切过的载体 pCold II-LrrG-Sip；PSL1：Sal I 和 Sac I 双酶切 pCold II-LrrG-Sip；PSL2：Sac I 和 BamH I 双酶切pCold II-LrrG-SipM: marker DL15000; Sip: colony PCR of Sip; LrrG: colony PCR of LrrG; EP: vector pCold II digested by BamH I;PS: vector pCold II-Sip digested by BamH I; PS1: vector pCold-Sip digested by BamH I and Sal I; PSL: vector pColdII-LrrG-Sip digested by BamH I; PSL1: vector pCold II-LrrG-Sip digested by Sal I and Sac I; PSL2: vector pColdII-LrrG-Sip digested by Sac I and BamH I.2.3 pCold II-LrrG-Sip 原核表达载体的诱导表达阳性菌株在不同条件下诱导，目的蛋白在沉淀和上清中的表达量表现出差异。其中 IPTG 浓度对目的蛋白表达的量影响不大(图 1-3，A)，因此选用 0.5 mmol·L-1

图 1-3、不同诱导条件下 pCold II-LrrG-Sip 的表达分析Fig.1-3The expression analysis of pCold II-LrrG-Sip at different inducing conductionA、不同 IPTG 浓度诱导下 pCold II-LrrG-Sip 的表达分析。IP0：未加 IPTG 诱导的对照；0.1、0.5、1：IPTG的浓度分别为 0.1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1的全菌蛋白A, The expression analysis of pCold II-LrrG-Sip at different IPTG concentration. IP0: the control without IPTGinducing; 0.1, 0.5, 1: total protein after inducing at IPTG concentration of 0.1 mmol·L-1, 0.5 mmol·L-1and 1.0mmol·L-1respectively.B、不同诱导时间下 pCold II-LrrG-Sip 的表达分析。TI6’、TI9’、TI12’：未加 IPTG 条件下诱导 6h、9h、12h的对照；6、9、12：诱导时间分别为 6h、9h、12h 的全菌蛋白B, The expression analysis of pCold II-LrrG-Sip at different inducing time. TI6’, TI9’, TI12’: the control induced by6 h, 9 h, 12 h without IPTG; 6, 9 and 12: total protein after inducing by 6 h, 9 h, 12 h respectively.C、不同诱导温度下 pCold II-LrrG-Sip 的表达分析。TE10’、TE15’、TE22’：在 10℃、15℃、22℃下未加 IPTG诱导的对照；10、15、22：诱导温度分别为 10℃、15℃、22℃的全菌蛋白C, The expression analysis of pCold II-LrrG-Sip at different inducing temperature. TE10’, TE15’, TE22’: the control
【参考文献】

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本文编号：2839692