大黄鱼MAPK家族部分基因克隆与表达分析

发布时间：2020-10-14 09:23

　　 温度变化对鱼类的多种生理活动有重要影响,温度胁迫也与病害的大规模爆发密切相关,从而影响鱼类养殖业的健康发展。大黄鱼是我国最重要的海水经济养殖鱼类之一,环境温度骤变与病害频发,严重制约了其健康发展。因此,从温度和免疫两个方面研究大黄鱼应对环境应激和病原侵染的反应机制,对于提高大黄鱼自身抗病能力具有重大意义。本研究克隆了大黄鱼MAPK家族中JNK亚家族中的JNK1、JNK2、JNK3三个基因,p38基因,ERK亚家族中的ERK2基因和ERK5家族的ERK5基因的全长cDNA序列,并分析了它们的结构特征;研究了它们在大黄鱼不同组织的表达谱,以及10°C与35°C的温度胁迫和病原分子模式刺激后,它们在LCK细胞系中的表达变化;观察了其在LCK细胞系中的亚细胞定位;并深入分析了p38在大黄鱼抵抗温度胁迫过程中的角色。具体结果如下:(1)大黄鱼JNK1基因全长cDNA为1970bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为1335bp,编码444个氨基酸;5’非翻译区(untranslated region,UTR)为249bp,3’UTR为386bp。预测分子量(molecular weight,Mw)大小为49.57kDa,等电点(isoelectric point,pI)为6.57。生物信息学预测JNK1包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(Serine/Threonine protein kinases catalytic domain,S_TKc)和TPY双磷酸化位点。JNK1基因在大黄鱼的鳃中表达量最高,而在脾中表达量最低。多聚肌苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)和鞭毛蛋白(flagellin)刺激均可诱导JNK1在LCK细胞系中表达显著增加(p0.05),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和肽聚糖(peptidoglycan,PGN)则显著抑制JNK1的激活(p0.01)。在10°C和35°C刺激的LCK细胞系中,温度胁迫后JNK1的表达与对照组没有显著变化。JNK1基因在LCK细胞系中的细胞核与细胞质中均有表达。推测大黄鱼JNK1基因在poly I:C和鞭毛蛋白刺激的细胞信号通路中可能发挥作用。大黄鱼JNK2序列包括193bp的5’端UTR,983 bp的3’端UTR和1260 bp的ORF,共编码420个氨基酸,预测Mw为47.59kDa,pI约为5.07。JNK2含有MAPK家族特有的S_TKc和TPY双磷酸化位点。JNK2基因在大黄鱼的血液中的表达量最高,而在肌肉中表达量最低。LPS和PGN刺激均可诱导JNK2在LCK细胞系中上调表达(p0.01)。Poly I:C刺激后JNK2表达下调(p0.01)。鞭毛蛋白刺激对JNK2表达无显著影响。温度刺激LCK细胞系,JNK2基因的表达量无显著性变化。JNK2基因在LCK细胞系中的细胞核与细胞质中均有表达。结果表明JNK2可能在LPS和PGN刺激的细胞信号转导通路中发挥重要作用。大黄鱼JNK3基因全长1669bp,包括一个122bp的5’UTR,126bp的3’UTR,以及1422bp的ORF,共编码473个氨基酸,预测Mw为53.63kDa,PI约为6.86。JNK3含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(S_TKc)和TPY双磷酸化位点。JNK3基因主要在脑中的表达量较高,而在肝中表达量最低。Poly I:C和鞭毛蛋白刺激均可诱导JNK3在LCK细胞系中表达(p0.01)。LPS和PGN刺激JNK3其表达量与对照组相比会下调。在10°C刺激LCK细胞系中,JNK3的表达趋势轻微上调(p0.05)。高温刺激对JNK3的表达无显著变化。JNK3基因在LCK细胞系中的细胞核与细胞质中均有表达。结果表明,JNK3可能在Poly I:C和鞭毛蛋白诱导的生理反应中发挥作用。(2)p38全长cDNA序列1716bp,5’UTR为143bp,3’UTR为488bp,其中ORF为1086bp,共编码361个氨基酸,预测Mw为41.67 kDa,PI为5.4。大黄鱼p38的氨基酸含有保守的TGY基序,并且具有谷氨酸/天冬氨酸位点(ED site)和底物结合位点(ATRW)和S_TKc。p38基因在大黄鱼的各个组织中广泛表达,其中在小肠中表达量最高。LPS、PGN、Poly I:C和鞭毛蛋白均可诱导p38转录水平表达上调(p0.01)。10°C和35°C刺激激可增加p38在mRNA水平的表达量(p0.01)。p38基因在LCK细胞系中的细胞核与细胞质中均有表达。低温和高温刺激均可诱导p38在蛋白水平的磷酸化,并随着时间推移,其磷酸化程度增加(p0.01)。在低温和高温刺激的LCK细胞系中,p38磷酸化抑制剂可显著抑制p38的磷酸化水平(p0.05)。Hsp27的转录水平在低温刺激的LCK细胞系中表达量上调(p0.01),受到抑制剂处理后,其在转录水平显著下调(p0.05)。经高温诱导和抑制剂处理后,发现Hsp27在转录水平的显著上调(p0.05),并不受抑制。在10°C和35°C刺激及抑制剂处理的LCK细胞系中,10°C和35°C处理可使得Caspase3在转录水平的表达上调,经抑制剂处理后,Caspase3的表达不受抑制。结果表明,病原刺激和温度刺激均可激活p38,而抑制剂处理可有效抑制Hsp27在mRNA水平的表达,对Caspase3则无影响。(3)大黄鱼ERK2基因全长cDNA序列为1910bp,5’UTR为143bp,3’UTR为658bp,ORF为1110bp,共编码369个氨基酸。预测Mw为42.1kDa,PI为6.19。ERK2氨基酸中有S_TKc结构域,HRD催化位点,TEY双磷酸化位点及核定位信号SPS和甘氨酸富集区。大黄鱼ERK2基因在脑中表达量最高,而在肝脏中表达量最低。Poly I:C和鞭毛蛋白刺激均可激活ERK2在LCK细胞系中表达(p0.05)。低温可抑制ERK2在LCK细胞系中的激活(p0.01),高温则可激活ERK2在LCK细胞系中的表达(p0.05)。ERK2基因在LCK细胞系中的细胞核与细胞质中均有表达。结果表明,ERK2可能参与Poly I:C和鞭毛蛋白诱导的信号转导通路中。(4)大黄鱼ERK5基因全长cDNA序列3720bp,5’UTR为103bp,3’UTR为264bp,ORF为3375bp,共编码1124个氨基酸。预测Mw为123.27kDa,PI为6.6。ERK5氨基酸中有S_TKc结构域,HRD催化位点,TEY双磷酸化位点及核定位信号NLS和MEK5结合位点。大黄鱼ERK5基因在鳃中表达量最高,而在小肠中表达量最低。Poly I:C和鞭毛蛋白刺激均可诱导ERK5在LCK细胞系中的激活(p0.01)。高温和低温均可抑制ERK5在LCK细胞系中的表达(p0.01)。ERK5基因在LCK细胞系中的细胞核与细胞质中均有表达。结果表明,ERK5可能参与到Poly I:C和鞭毛蛋白诱导的信号转导通路中。
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

铺满培养瓶后，将细胞传代至 6 孔板养 4-6 h，pfectamine 3000 转染试剂操作步骤， 1μg/μL 的 Hoechst 33342 稀释液中，NK2、JNK3 全长 cDNA 克隆鳃、肝、头肾总 RNA 抽提完毕后经 28S 和 18S rRNA 清晰可见，表明 R

图 2.2 大黄鱼 JNK1 基因 ORF 验证M:100bp DNA Ladder；1：鳃；2：脑 基因全长 cDNA 序列分析全长为 1970bp，其中开放阅读框（ORF）为 131cDNA 编码 444 个氨基酸，预测分子量大小为一个 RNA 不稳定基序 ATTTA 结构。 氨基酸序列分析结果分析显示，JNK1 主要有一个结构域，即 S_TK软件 ESyPred3D 及 3D 模型查看软件 RASMOL 2.3（b）所示。

图 2.2 大黄鱼 JNK1 基因 ORF 验证M:100bp DNA Ladder；1：鳃；2：脑1 基因全长 cDNA 序列分析全长为 1970bp，其中开放阅读框（ORF）为 131cDNA 编码 444 个氨基酸，预测分子量大小为 一个 RNA 不稳定基序 ATTTA 结构。1 氨基酸序列分析结果分析显示，JNK1 主要有一个结构域，即 S_TKc软件 ESyPred3D 及 3D 模型查看软件 RASMOL 2.3（b）所示。
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本文编号：2840474