拟态弧菌感染鱼肠组织差异蛋白组分析及OmpU互作蛋白鉴定

发布时间：2020-10-17 14:16

　　 拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种严重危害水产养殖业的病原菌,可引起养殖鱼类的腹水病。从蛋白质组学角度研究拟态弧菌的分子致病机制,可为防治鱼类腹水病提供新的模式。我们前期研究已证实肠黏膜组织是拟态弧菌黏附定植与生长繁殖的靶组织,亦探明外膜蛋白U(Outer membrance protein U,OmpU)是该菌的重要黏附素,但是OmpU蛋白在肠黏膜组织中的互作蛋白尚不清楚,拟态弧菌致病的分子调控机制也未明晰。对此,本课题利用蛋白质组学技术对拟态弧菌感染前后草金鱼肠黏膜组织进行差异蛋白质组研究,为揭示拟态弧菌的分子致病机制,研发新型抗菌制剂奠定基础。本课题具体开展了以下研究工作:1草金鱼感染模型的建立用浓度为1.15×10~(10)CFU/mL的拟态弧菌04-14分离株菌液以浸泡和腹腔注射方式感染草金鱼,结果发现腹腔注射后12h,实验鱼开始发病、死亡;而浸泡感染的实验鱼未发生全部死亡,由此确定最佳感染途径为腹腔注射。用4个不同感染剂量的菌液(3.45×109CFU/尾、2.32×109CFU/尾、1.75×109CFU/尾和1.14×109CFU/尾)腹腔注射实验鱼,结果显示3.45×109CFU/尾感染组实验鱼在12h开始发病,随后全部死亡,而其它组实验鱼未全部死亡,说明拟态弧菌腹腔注射感染草金鱼的最小致死量3.45×109CFU/尾。2肠黏膜组织蛋白提取方法的确定分别采用NP-40裂解法、含蛋白酶抑制剂的NP-40裂解法和丙酮沉淀法提取肠黏膜组织总蛋白,通过SDS-PAGE分析和蛋白浓度测定评价提取效果。结果显示,三种提取方法所获得的蛋白质浓度分别为10.05mg/mL、11.81mg/mL和1.71mg/mL,以含蛋白酶抑制剂的NP-40裂解法提取的蛋白浓度最高、条带最多,确定该法为肠黏膜组织蛋白提取的最佳方法。3感染前后肠黏膜组织差异蛋白组分析以最小致死量拟态弧菌腹腔注射感染草金鱼,分别取感染前和濒死期实验鱼肠黏膜组织,每一时间点做3个生物学重复。用含蛋白酶抑制剂的NP-40裂解法提取肠黏膜组织蛋白,然后利用2-D电泳分离肠黏膜组织蛋白,并使用PDQuest8.0分析2-D凝胶图谱,结果发现感染前后共有12个蛋白点发生明显变化,其中6个蛋白点表达量上调16倍,6个蛋白点表达量下调4倍。将12个蛋白点进行MOLDI-TOF-MS质谱鉴定,共鉴定出12种蛋白,分别为肌凝蛋白、血清转铁蛋白、转铁蛋白变异体A1、α肌动蛋白、载脂蛋白A-I、过氧化物酶、淀粉酶、蛋白质二硫键异构酶前体、转铁蛋白变异体A、β-肌动蛋白、铜锌超氧化物歧化酶和胃调蛋白。GO功能注释分析、Pathway通路分析和STRING分析表明,这些蛋白存在直接或间接互作关系,参与9个生物学过程,涉及9个信号传导通路,在细胞结构组建、免疫、抗氧化和能量代谢等方面发挥重要作用。4 OmpU互作蛋白的筛选与鉴定按常规的蛋白诱导表达和纯化方法,制备His-OmpU融合蛋白。以His-OmpU蛋白为诱饵蛋白,肠黏膜组织蛋白为猎物蛋白,用His-tag pull down试剂盒筛选肠黏膜组织蛋白中OmpU互作蛋白。SDS-PAGE分析显示,与诱饵蛋白对照组和猎物蛋白对照组比较,Pull down试验组出现了5条明显的差异蛋白条带。经液质联用质谱鉴定,5条差异蛋白条带分别对应细丝蛋白A、α-肌动蛋白2、调宁蛋白2、α-辅肌动蛋白4和转胶蛋白。GO功能注释分析表明5个互作蛋白分为二类,一类为细胞骨架蛋白(α-肌动蛋白2),另一类为细胞骨架调节蛋白(细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白4、转胶蛋白2和调宁蛋白2)。它们除了参与许多重要的细胞活动外,在病原菌的黏附、内化和致病过程中也发挥重要作用。综上所述,本研究探明了拟态弧菌感染前后鱼肠黏膜组织蛋白质组差异表达模式,初步鉴定OmpU黏附素的互作蛋白。为揭示拟态弧菌的分子致病机制,研发新型抗菌制剂奠定了基础。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S941.4
【部分图文】：

动、腹部轻微肿大等症状；12h 后实验鱼张嘴呼吸、精溃烂出血、身体失去平衡的游动；24h 后实验鱼发生死、肝脾出血、部分肝脏液化（图 2-1）。病过程，取感染前与感染后 12h（濒死期）各 3 尾，采成粉末状，-80℃保存，用于后续检测。

同时使用改良型 BCA 法蛋黏膜组织总蛋白分别为 10.05mg/m抑制剂的 NP-40 裂解法）和 1.71mg/的 NP-40 裂解法提取效果最好。M 1 2 3 4

从感染前后肠黏膜组织总蛋白双向凝胶图谱中分别检测到238和216个，蛋白匹配率为87%。感染前后比较得到12个差异蛋白，其中6个点蛋白表达上图2-3中1-6，上调16倍），6个蛋白表达下调（图2-3中7-12, 下调4倍。）pH 310 pH 3 1031
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本文编号：2844899